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标题: 幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究 [打印本页]
作者: 薛家宾    时间: 2008-1-31 16:24
标题: 幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究
幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究/ |" q& m+ y6 P, q$ k
杨龙圣，薛家宾，徐为中，胡元亮
  N8 q% u/ O$ g; Q
8 i3 a! T5 h; ~0 x3 h兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（RHD virus，RHDV）引起的家兔的一种急性、高度接触性传染病,常呈爆发性流行，发病率和死亡率极高，给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒（RHDV）对青年、成年兔致病高，对二月龄以下幼兔一般不感染发病[1～3]。近年来的幼兔发生兔出血症逐渐增多[4～6]，一些学者认为初免日龄在45日龄左右为宜，最好是用兔瘟单苗加倍免疫注射，60日龄左右再加强免疫一次[7]。而一部分养殖单位在仔兔断奶前后（30-35日龄）就免疫兔瘟苗，仅用单倍剂量，不再加强免疫，有时会发生免疫注射兔瘟苗后仍然发生兔瘟病[8][9]。为探明免疫注射后仍然发病的根源，进行了本试验研究。旨在通过免疫日龄及剂量与抗体产生之间的关系研究，明确幼兔兔瘟苗免疫的客观规律。
& X  `1 o5 T' Z) i1 材料与方法. X' ^- g) X- j9 }8 t
1.1 材料! P! a& ]; @1 j6 ]4 ~
新西兰兔，35、40、45日龄。兔病毒性出血症组织灭活疫苗（批号20041201），阳性血清，阴性血清，兔出血症病毒（RHDV，皖阜株）均由江苏省农业科学院兽医研究所提供；人“O”型红细胞，由南京军区总医院提供。
- o/ A! _% @. E3 [6 lTGL-16G台式高速离心机，由上海医用分析仪器厂生产；WMK-2型37℃恒温箱，南京试验仪器厂；100µl移液枪，eppendorf公司生产；50孔U型血凝板。
; T3 p( k# J' s; W' M% q1.2 动物分组与血样处理- C! F* J$ U! g" f
分别取35、40、45日龄幼兔各30只，每个日龄组分不免疫、免疫剂量1、免疫剂量2、免疫剂量3、免疫剂量4五个处理组，共15组，每个剂量组6只幼兔，颈部皮下注射兔瘟疫苗。注射疫苗后，每周1次耳静脉或心脏采血。血液置37℃温箱内1小时，10000rpm/min离心10min，吸取上清。血清置56℃水浴锅内30min后，用于测定抗体效价。
4 k: \- A8 ~* _3 k1.3 兔瘟抗体效价的测定: e$ E4 A' L8 `* |$ |1 K+ k( B
微量血凝抑制试验（HI）方法检测兔瘟抗体[10]。取50µl待检血清用等量生理盐水进行倍比稀释6个梯度，分别在每孔加入等量的4单位血凝病毒，37℃感作30min，加入等量的1％人“O”型红细胞，4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清作为对照。结果以平均数±标准差表示，用SPSS软件从剂量和日龄两个角度作统计分析。) r& e4 f1 T$ D+ a$ E  y
2 结果与分析& Q( X8 w+ ~8 Y* T' I1 C) K
2.1 35日龄不同剂量组的抗体效价
! n; t/ G8 h; L9 I' d35日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4后，其抗体产生速度较剂量1组快，剂量2、3、4组抗体效价一直显著高于剂量1组，剂量2、3、4组抗体效价峰值5.83显著高于剂量1组峰值3.25，有效抗体维持时间(>7周)大于剂量1组的2周。35日龄组幼兔剂量2、3、4组之间抗体产生速度、峰值、维持时间均无显著差异（表1）
" t8 ]& a( t8 n! L" T$ i表1  35日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化1 y1 S5 S6 U. o* H8 c
Table 1. Diversification of the antibody of the 35 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
9 O8 O* b4 ~. x8 {8 i) n) |# D' f免疫1 x1 {" o  q: k7 j6 F! u
剂量        免疫前        免疫后
, }) Y9 `) s; L7 l1 _& u7 b                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周, w8 f$ T. i' U
0        2.50±0.41        1.25±0.95b        1.00±0.82c        0.75±0.96c        0.25±0.50d        0.25±0.50d        0.00±0.00d        0.00±0.00c
( y  v" l& t3 y4 m/ \- S1        2.50±0.41        3.25±0.50a        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00c        1.00±0.00c        0.75±0.50c        0.00±0.00c
( m0 O. G* E. g" M  j) R  i# h! d2        2.00±1.00        4.00±0.00a        4.66±0.58a        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71b        4.50±0.73ab        4.50±0.53a, D. ~5 S# x( q8 g: o( E& g+ ~5 ~; l
3        2.00±1.00        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00b        5.25±0.35ab        4.25±0.23b        4.00±0.34b
, T+ F3 y: a' o6 J; x% ~) s4        2.33±0.58        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.83±0.29a        5.50±0.00a        4.75±0.56a        4.33±0.26ab
  y& g6 y5 }: Z& Z, i: g2 J* o/ r. N注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
( U; c! _6 Z+ i% a% TNote: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same as follows.- J$ f/ t% U: ^# U/ w
* A2 r5 W+ d, e4 T7 n2 V, q5 u0 ^9 F
2.2 40日龄不同剂量组的抗体效价
* i( n3 e9 [" B% d* Z" N3 T40日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，剂量2、3、4组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，剂量2、3、4组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表2）
- l* ?2 i1 @& t8 r  I# {; Y表2  40日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
. Q$ g  J/ k9 v9 STable 2 .Diversification of the antibody of the 40 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
( t7 {1 m% z8 e* e- j* u2 f, G免疫剂量        免疫前        免疫后
$ T& ?" O4 P( D; G) I, N. [* P                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周/ k* a+ }  b, @
0        1.25±0.58        1.00±0.82b        0.75±0.96b        0.25±0.50b        0.20±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
$ y+ E8 H1 s6 D+ H! A1        1.25±0.96        3.00±0.82a        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96b        3.00±0.82b        2.13±0.50b        1.83±0.58b  T, Y! H+ I& n+ b) j  B
2        1.33±0.58        4.33±1.15a        5.83±0.29a        5.17±0.29a        5.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        4.50±0.00a
& L! X$ X& a7 a6 z3        1.27±0.58        4.00±1.00a        5.50±0.50a        5.17±0.29a        5.00±1.00a        5.00±0.58a        5.00±0.29a        4.50±0.00a8 O: D, x0 P/ }, I9 O$ F
4        1.33±0.58        4.33±0.58a        5.83±0.29a        5.17±0.35a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        5.00±0.35a        4.50±0.29a
" f( N5 ^/ V" O* a9 T& s+ q8 ~- j8 Y
2.3 45日龄不同剂量组的抗体效价3 y  Y! S% `5 w6 y6 R+ W9 F  E
45日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，免疫后第5周，2～4单位剂量剂量组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，2～4单位剂量剂量组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表3）。
2 N, m2 q) v% p3 T; Q+ ]" {表3  45日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
; [# V; n2 k7 E9 E% ETable 3 .Diversification of the antibody of the 45 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
+ H4 l1 P+ j4 D1 n2 X7 [- O9 C1 N免疫剂量        免疫前        免疫后- V" _; {6 E/ }! E
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周6 J! z; q% |9 F3 o- v
0        1.00±0.57ab        0.80±0.96b        0.35±0.50b        0.25±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c3 }$ M8 q: Z* O/ T, C. ~+ b
1        2.00±0.82a        3.25±1.26a        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96b        3.25±1.26b        2.38±1.79b        2.00±1.41b
" b% S' Y3 X, N" \  ~9 C2        1.00±0.00ab        4.00±1.00a        5.17±0.58a        4.83±0.29b        5.16±0.76ab        5.50±0.45a        5.50±0.00a        4.75±0.59a/ ]. }+ I/ y* k6 f; U
3        1.00±1.00ab        4.47±0.50a        5.25±1.06a        5.50±0.00a        5.75±0.35a        5.25±1.06a        5.00±0.50a        4.50±0.56a$ u" a: N' {0 o0 W& T$ v
4        0.33±0.58b        4.33±0.58a        5.50±0.00a        5.50±0.00a        5.25±0.35ab        5.25±0.35a        5.00±0.50a        4.50±0.36a
2 O/ H) j9 b9 a- g- ?  U; W# ^
- O4 i2 L! I& {& P$ d! j! u! P3 i( f2.4 35、40、45日龄组免疫剂量1疫苗后的抗体效价
# G  g/ H$ _8 I, z4 N) K- X注射剂量1疫苗时，免疫后第1周，各日龄组之间抗体效价没有显著差异，免疫后2～3周，3个日龄组抗体效价均上升至峰值，40、45日龄组抗体效价均显著高于35日龄组，40、45日龄组之间抗体效价没有显著差异，35日龄组有效抗体维持时间为2周，40～45日龄有效抗体维持时间为4周（表4）
/ M3 b! h. j# Z& {, L8 z  t' k) G表4  不同日龄幼兔免疫剂量1后抗体变化比较' ]* n) w2 y- \1 s4 i& M
Table 4 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 1-unit dose of vaccine " T, a4 J# J" d5 k
免疫日龄        免疫前        免疫后
- |8 _' D9 b5 e3 L# Q2 P6 O2 O                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
7 P1 B  k6 Z4 K* S7 H0 _0 W35日龄        2.50±0.41a        3.25±0.50        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00b        1.00±0.00b        0.75±0.50b        0.00±0.00b! e0 g3 W& c5 V- D
40日龄        1.25±0.96b        3.00±0.82        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96 ab        3.00±0.82a        2.13±0.50a        1.83±0.58a0 G/ J- n% |5 j, {# t* ?" }
45日龄        2.00±0.82ab        3.25±1.26        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96a        3.25±1.26a        2.38±1.79a        2.00±1.41a
* x1 U# r! e* l0 k注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。( P' b9 `/ z- J" \  |& a6 _! K
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.
2 }2 `3 V$ I( \% x: ]9 O$ D  l! |$ Q$ k) H- z
2.5 35、40、45日龄组免疫剂量2疫苗后的抗体效价- d% T: ~6 B# \* w/ W2 N" `
注射剂量2兔出血症疫苗之后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表5）8 B$ k8 c% ^! z. l7 o
表5  不同日龄幼兔免疫剂量2后抗体变化比较
& t$ O) ^; R, I6 Z& j& _  C& E* DTable 5 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 2-unit dose of vaccine 1 z' d. I) x# c, I
免疫日龄        免疫前        免疫后
0 w9 o, B/ }6 B% q                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
9 ~+ F  ^1 z9 g35日龄        2.00±1.00        4.00±0.00        4.66±0.58b        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71        4.50±0.73b        4.50±0.53
; t, W2 F. e0 k40日龄        1.33±0.58        4.33±1.15        5.83±0.29a        5.17±0.29ab        5.33±0.58ab        5.33±0.00        5.00±0.00ab        4.50±0.00
7 {" A7 l  K' r. p# }45日龄        1.00±0.00        4.00±1.00        5.17±0.58ab        4.83±0.29b        5.16±0.76b        5.50±0.00        5.50±0.00a        4.75±0.59
6 K* H& w# N( P$ @) R% q+ ]" j/ I
$ N( J. i9 Q# ~2.6 35、40、45日龄组免疫剂量3、4疫苗后的抗体效价
  q' i+ H  `8 w+ s用剂量3、4注射兔出血症疫苗后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表6、7）。
4 r$ c& J/ h( D, I表6  不同日龄幼兔免疫剂量3后抗体变化比较/ i* a( q, R) P- x4 e
Table 6 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 3-unit dose of vaccine
6 z3 O3 K( J- ]# z" `; K8 A免疫! p- [& k! J5 R: f, T0 ]- u
日龄        免疫前        免疫后
" u! ~& C9 m- T6 b( y! T. W                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
% D0 `, [5 d; h# n- U" P' q* m35日龄        2.00±1.00        4.00±1.00        4.33±0.58        5.33±0.58        5.00±0.00        5.25±0.35        4.25±0.23b        4.00±0.34
) _" l: L; S' o9 B40日龄        0.67±0.58        4.00±1.00        5.50±0.50        5.17±0.29        5.00±1.00        5.00±0.00        5.00±0.29a        4.50±0.00% N5 g# Y1 h/ s7 U
45日龄        1.00±1.00        4.47±0.50        5.25±1.06        5.50±0.00        5.75±0.35        5.25±1.06        5.00±0.50a        4.50±0.56
) n5 B# s% Y1 l8 o. P
8 r6 S8 u5 ^% C" X+ W' {  e表7  不同日龄幼兔免疫4单位剂量后抗体变化比较9 s, h$ o& b  S/ F, j, ]# \
Table 7 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 4-unit dose of vaccine ! s% T: x4 g, V+ ^2 `8 ^* H
免疫2 V# N% _: e7 w
日龄        免疫前        免疫后" U% q! m* L3 p5 N2 _- z- O
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
) W  C' A% C8 q2 d35日龄        2.33±0.58a        4.00±1.00        4.33±0.58b        5.33±0.58        5.83±0.29        5.50±0.00        4.75±0.56        4.33±0.26& G( A$ K* V7 q2 r" \$ x
40日龄        1.33±0.58ab        4.33±0.58        5.83±0.29a        5.17±0.35        5.33±0.58        5.00±0.00        5.00±0.35        4.50±0.29
: ~3 @3 Y5 Z- c  G( j$ ?6 Z45日龄        0.33±0.58b        4.33±0.58        5.50±0.29a        5.50±0.00        5.25±0.35        5.25±0.35        5.00±0.50        4.50±0.365 p  f8 Y. U1 i$ Q( |" q  F
% B+ m9 H8 a+ Z) ?* c
3 小结与讨论! z' Y9 J: U6 Y
3.1 相同日龄免疫剂量与抗体产生之间的关系
' L& U( N) e0 ?7 M35日龄的剂量2、3、4组的抗体峰值、有效抗体维持时间、抗体产生速度均显著大于剂量1组，但是剂量2、3、4组之间的抗体峰值、有效抗体维持时间没有显著差异，抗体产生速度与40、45日龄的剂量2、3、4组均为1周，抗体峰值的产生较40、45日龄的剂量2、3、4组仅慢1周。40日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。45日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。: F% d1 Y0 l8 [% s" k+ G- F
3.2 同一剂量的不同免疫日龄与抗体产生之间的关系
" C- r" V1 J; ]2 r免疫结果表明，不同日龄在免疫剂量1时，免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关。35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值均显著小于其它日龄组。免疫剂量2～4时，35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值与其它日龄组之间无显著差异。说明加大剂量之后，可以解决当前存在的免疫程序问题。% c! f& j% Y4 W7 `% J' Y, E+ w
        目前，国内幼兔免疫机理方面的研究开展很少，人们对其免疫规律以及机理还不是十分清楚。本研究结果证明了兔出血症免疫程序中确实存在一些问题，同时提出了一些建议以供参考，并为进一步的深层次研究提供了实践依据。
1 M4 _5 i" {2 X
8 ~+ Q5 n5 b. f: ?% }3 q[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-1-31 16:25 编辑 ]
作者: 王高    时间: 2008-1-31 16:52
好
作者: qiuhuangang    时间: 2008-2-2 00:50
谢谢教授........
作者: 王高    时间: 2008-2-2 10:48
从薛老师得到的提示应该是35日龄的小日龄可以注射，加倍注射效果好。但是我们实际当中的商品肉兔都是28日龄断奶，到35日龄也隔了好几天了。我想问实际当中刚刚断奶时可否注射兔瘟疫苗？请薛老师看看行不行。
作者: 1985su    时间: 2008-2-2 14:04
兔瘟/波氏。魏氏苗的效果确实。大肠杆菌根本就多余，巴氏还有一定的用途
作者: 薛家宾    时间: 2008-2-3 08:45
标题: 回复 4楼 的帖子
建议再看一下另一篇文章-免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响.
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[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-2-3 08:46 编辑 ]
作者: 张连春    时间: 2008-2-3 20:45
:vic tory:



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