幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究

薛家宾

幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究
! |8 }7 D+ a. O杨龙圣，薛家宾，徐为中，胡元亮

2 `8 e8 b& g) }兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（RHD virus，RHDV）引起的家兔的一种急性、高度接触性传染病,常呈爆发性流行，发病率和死亡率极高，给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒（RHDV）对青年、成年兔致病高，对二月龄以下幼兔一般不感染发病[1～3]。近年来的幼兔发生兔出血症逐渐增多[4～6]，一些学者认为初免日龄在45日龄左右为宜，最好是用兔瘟单苗加倍免疫注射，60日龄左右再加强免疫一次[7]。而一部分养殖单位在仔兔断奶前后（30-35日龄）就免疫兔瘟苗，仅用单倍剂量，不再加强免疫，有时会发生免疫注射兔瘟苗后仍然发生兔瘟病[8][9]。为探明免疫注射后仍然发病的根源，进行了本试验研究。旨在通过免疫日龄及剂量与抗体产生之间的关系研究，明确幼兔兔瘟苗免疫的客观规律。
$ h' P0 p# a7 J) W3 A1 材料与方法
5 q8 K. ~" `; I, B  g4 C6 C1.1 材料
新西兰兔，35、40、45日龄。兔病毒性出血症组织灭活疫苗（批号20041201），阳性血清，阴性血清，兔出血症病毒（RHDV，皖阜株）均由江苏省农业科学院兽医研究所提供；人“O”型红细胞，由南京军区总医院提供。
" n0 e( |7 v8 D' D, y% t0 I3 T" _TGL-16G台式高速离心机，由上海医用分析仪器厂生产；WMK-2型37℃恒温箱，南京试验仪器厂；100µl移液枪，eppendorf公司生产；50孔U型血凝板。
: {8 N2 }$ H4 B) m" W! M$ S2 C1.2 动物分组与血样处理
: [' S/ e% q+ n* y分别取35、40、45日龄幼兔各30只，每个日龄组分不免疫、免疫剂量1、免疫剂量2、免疫剂量3、免疫剂量4五个处理组，共15组，每个剂量组6只幼兔，颈部皮下注射兔瘟疫苗。注射疫苗后，每周1次耳静脉或心脏采血。血液置37℃温箱内1小时，10000rpm/min离心10min，吸取上清。血清置56℃水浴锅内30min后，用于测定抗体效价。
/ q4 G2 I) J. s: {; }, K% {1.3 兔瘟抗体效价的测定
微量血凝抑制试验（HI）方法检测兔瘟抗体[10]。取50µl待检血清用等量生理盐水进行倍比稀释6个梯度，分别在每孔加入等量的4单位血凝病毒，37℃感作30min，加入等量的1％人“O”型红细胞，4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清作为对照。结果以平均数±标准差表示，用SPSS软件从剂量和日龄两个角度作统计分析。
/ \# b+ V$ \0 t" W3 h# }, B2 结果与分析
2.1 35日龄不同剂量组的抗体效价
% Q( X$ ?$ Q) z1 }35日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4后，其抗体产生速度较剂量1组快，剂量2、3、4组抗体效价一直显著高于剂量1组，剂量2、3、4组抗体效价峰值5.83显著高于剂量1组峰值3.25，有效抗体维持时间(>7周)大于剂量1组的2周。35日龄组幼兔剂量2、3、4组之间抗体产生速度、峰值、维持时间均无显著差异（表1）
. S3 k4 N7 A* ?8 R; A9 d% N# H3 {表1  35日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
/ y! U4 Z% `# P$ n: O# L. nTable 1. Diversification of the antibody of the 35 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
& d$ i+ u; O) V0 k/ k免疫
剂量        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
, S. ^3 K: u3 {' z& Y9 w, ]- `0        2.50±0.41        1.25±0.95b        1.00±0.82c        0.75±0.96c        0.25±0.50d        0.25±0.50d        0.00±0.00d        0.00±0.00c
1        2.50±0.41        3.25±0.50a        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00c        1.00±0.00c        0.75±0.50c        0.00±0.00c
2        2.00±1.00        4.00±0.00a        4.66±0.58a        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71b        4.50±0.73ab        4.50±0.53a
* M3 y1 T5 v/ ^# \5 v3        2.00±1.00        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00b        5.25±0.35ab        4.25±0.23b        4.00±0.34b
4        2.33±0.58        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.83±0.29a        5.50±0.00a        4.75±0.56a        4.33±0.26ab
7 g  X. u% `0 ~: J注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same as follows.

+ m1 \3 r/ s2 J, q2.2 40日龄不同剂量组的抗体效价
% G7 ~8 w7 j0 a* c40日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，剂量2、3、4组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，剂量2、3、4组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表2）
表2  40日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
Table 2 .Diversification of the antibody of the 40 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
7 [  {/ a! t2 A3 n免疫剂量        免疫前        免疫后
7 d! A( V1 ^% L5 `/ B5 i                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
' V9 h6 r$ B& u* f" |0        1.25±0.58        1.00±0.82b        0.75±0.96b        0.25±0.50b        0.20±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
1        1.25±0.96        3.00±0.82a        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96b        3.00±0.82b        2.13±0.50b        1.83±0.58b
6 ^5 D( C+ ]* S- Q6 d- r3 S2        1.33±0.58        4.33±1.15a        5.83±0.29a        5.17±0.29a        5.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        4.50±0.00a
1 v; l& a; o9 `5 s3        1.27±0.58        4.00±1.00a        5.50±0.50a        5.17±0.29a        5.00±1.00a        5.00±0.58a        5.00±0.29a        4.50±0.00a
) j9 R% n1 m0 g* m+ ?4        1.33±0.58        4.33±0.58a        5.83±0.29a        5.17±0.35a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        5.00±0.35a        4.50±0.29a

3 U. N% K) R4 B2 |0 R* E2 m2.3 45日龄不同剂量组的抗体效价
45日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，免疫后第5周，2～4单位剂量剂量组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，2～4单位剂量剂量组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表3）。
表3  45日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
Table 3 .Diversification of the antibody of the 45 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫剂量        免疫前        免疫后
0 N1 Z& a: X2 _- \3 u                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
0        1.00±0.57ab        0.80±0.96b        0.35±0.50b        0.25±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
1        2.00±0.82a        3.25±1.26a        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96b        3.25±1.26b        2.38±1.79b        2.00±1.41b
% {0 t: h, c( f+ h2 E# A3 x6 D# g) q2        1.00±0.00ab        4.00±1.00a        5.17±0.58a        4.83±0.29b        5.16±0.76ab        5.50±0.45a        5.50±0.00a        4.75±0.59a
3        1.00±1.00ab        4.47±0.50a        5.25±1.06a        5.50±0.00a        5.75±0.35a        5.25±1.06a        5.00±0.50a        4.50±0.56a
4        0.33±0.58b        4.33±0.58a        5.50±0.00a        5.50±0.00a        5.25±0.35ab        5.25±0.35a        5.00±0.50a        4.50±0.36a

2.4 35、40、45日龄组免疫剂量1疫苗后的抗体效价
5 w) H% q4 J+ y. o注射剂量1疫苗时，免疫后第1周，各日龄组之间抗体效价没有显著差异，免疫后2～3周，3个日龄组抗体效价均上升至峰值，40、45日龄组抗体效价均显著高于35日龄组，40、45日龄组之间抗体效价没有显著差异，35日龄组有效抗体维持时间为2周，40～45日龄有效抗体维持时间为4周（表4）
0 D  Z3 R% B4 O9 n8 U表4  不同日龄幼兔免疫剂量1后抗体变化比较
Table 4 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 1-unit dose of vaccine
免疫日龄        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
35日龄        2.50±0.41a        3.25±0.50        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00b        1.00±0.00b        0.75±0.50b        0.00±0.00b
40日龄        1.25±0.96b        3.00±0.82        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96 ab        3.00±0.82a        2.13±0.50a        1.83±0.58a
5 [/ v3 [! Q. w2 b6 B0 J45日龄        2.00±0.82ab        3.25±1.26        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96a        3.25±1.26a        2.38±1.79a        2.00±1.41a
, ?6 B, T- C5 O/ Q2 E1 U; @注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
. k3 {$ ^) ^1 }* T- x$ p) KNote: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.

2.5 35、40、45日龄组免疫剂量2疫苗后的抗体效价
; n% C" |8 B0 N9 V, s. w4 K注射剂量2兔出血症疫苗之后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表5）
表5  不同日龄幼兔免疫剂量2后抗体变化比较
* h2 b3 I/ i) X5 @3 A  hTable 5 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 2-unit dose of vaccine
免疫日龄        免疫前        免疫后
5 ]' h1 m2 c9 z# }% }                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
35日龄        2.00±1.00        4.00±0.00        4.66±0.58b        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71        4.50±0.73b        4.50±0.53
* v* i7 G. M: s+ v* {40日龄        1.33±0.58        4.33±1.15        5.83±0.29a        5.17±0.29ab        5.33±0.58ab        5.33±0.00        5.00±0.00ab        4.50±0.00
) e; ^6 T+ }, H9 _$ h8 d, H  Z45日龄        1.00±0.00        4.00±1.00        5.17±0.58ab        4.83±0.29b        5.16±0.76b        5.50±0.00        5.50±0.00a        4.75±0.59
. V! N$ t9 s3 t. T1 Y9 c
2.6 35、40、45日龄组免疫剂量3、4疫苗后的抗体效价
7 K4 A3 j0 E- C# n; }+ i用剂量3、4注射兔出血症疫苗后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表6、7）。
表6  不同日龄幼兔免疫剂量3后抗体变化比较
Table 6 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 3-unit dose of vaccine
4 J7 K+ d) |  ]6 X5 B免疫
& h7 k" ^# n4 m# B日龄        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
35日龄        2.00±1.00        4.00±1.00        4.33±0.58        5.33±0.58        5.00±0.00        5.25±0.35        4.25±0.23b        4.00±0.34
40日龄        0.67±0.58        4.00±1.00        5.50±0.50        5.17±0.29        5.00±1.00        5.00±0.00        5.00±0.29a        4.50±0.00
$ z+ i9 P) L( e: I0 Q* Q45日龄        1.00±1.00        4.47±0.50        5.25±1.06        5.50±0.00        5.75±0.35        5.25±1.06        5.00±0.50a        4.50±0.56

" @2 q& D" w- m* c# z0 [5 T) C表7  不同日龄幼兔免疫4单位剂量后抗体变化比较
$ @$ C0 z& Y2 |Table 7 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 4-unit dose of vaccine
免疫
' C2 f3 G& C6 `/ |5 }* T2 g日龄        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
6 T- c" {7 M2 G/ q# k5 Q1 t35日龄        2.33±0.58a        4.00±1.00        4.33±0.58b        5.33±0.58        5.83±0.29        5.50±0.00        4.75±0.56        4.33±0.26
$ y( S2 h  z5 u40日龄        1.33±0.58ab        4.33±0.58        5.83±0.29a        5.17±0.35        5.33±0.58        5.00±0.00        5.00±0.35        4.50±0.29
45日龄        0.33±0.58b        4.33±0.58        5.50±0.29a        5.50±0.00        5.25±0.35        5.25±0.35        5.00±0.50        4.50±0.36
  Q- v- p) c2 e/ e- ^! S$ i4 D# X
# H4 Y1 j/ Z5 \2 ?) K' y0 r+ p6 z: z3 小结与讨论
3.1 相同日龄免疫剂量与抗体产生之间的关系
( t2 x6 G6 e; A6 q% e/ w3 z% t35日龄的剂量2、3、4组的抗体峰值、有效抗体维持时间、抗体产生速度均显著大于剂量1组，但是剂量2、3、4组之间的抗体峰值、有效抗体维持时间没有显著差异，抗体产生速度与40、45日龄的剂量2、3、4组均为1周，抗体峰值的产生较40、45日龄的剂量2、3、4组仅慢1周。40日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。45日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。
3.2 同一剂量的不同免疫日龄与抗体产生之间的关系
0 `' ~( j$ t* Z* G5 v免疫结果表明，不同日龄在免疫剂量1时，免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关。35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值均显著小于其它日龄组。免疫剂量2～4时，35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值与其它日龄组之间无显著差异。说明加大剂量之后，可以解决当前存在的免疫程序问题。
        目前，国内幼兔免疫机理方面的研究开展很少，人们对其免疫规律以及机理还不是十分清楚。本研究结果证明了兔出血症免疫程序中确实存在一些问题，同时提出了一些建议以供参考，并为进一步的深层次研究提供了实践依据。

[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-1-31 16:25 编辑 ]

王高

好

qiuhuangang

谢谢教授........

王高

从薛老师得到的提示应该是35日龄的小日龄可以注射，加倍注射效果好。但是我们实际当中的商品肉兔都是28日龄断奶，到35日龄也隔了好几天了。我想问实际当中刚刚断奶时可否注射兔瘟疫苗？请薛老师看看行不行。

1985su

兔瘟/波氏。魏氏苗的效果确实。大肠杆菌根本就多余，巴氏还有一定的用途

薛家宾

建议再看一下另一篇文章-免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响.
, f) S; v0 v' [  S$ P4 c2 B
[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-2-3 08:46 编辑 ]

张连春

:vic tory: