喹诺酮耐药性研究摘要

lipeng900900

内容摘要
氟喹诺酮类药物(即第三代喹诺酮类药物)自1978年上市以来因其疗效显著而得到了国内外的广泛重视.随着氟喹诺酮类药物(FQs)在中国兽医临床上的大量广泛应用,其耐药性问题越来越严重,成为兽医和人医临床关注的热点.细菌对FQs耐药机制普遍认为主要起因于染色体基因突变.在耐药机制复杂、对FQs耐药率极高的大肠杆菌中,有关质粒介导的耐药性报道却不多.该课题以研究大肠杆菌对FQs等常用抗菌药物的耐药谱及质粒图谱为基础,以多重高度耐药大肠杆菌为研究对象,采用质粒转化实验和消除实验,对FQs耐药质粒及相关耐药基因进行了初步研究.首先提取临床分离FQs多重耐药大肠杆菌总质粒DNA,进行质粒DNA图谱的调查,并对其与耐药谱间的关系进行了初步研究.在含4μg/mL环丙沙星的伊红美蓝平板上筛选出212株FQs多重耐药大肠杆菌(猪场145株,鸡场67株),进行11种常用抗菌药物的药敏实验.通过质粒转化实验和消除实验,初步筛选出大肠杆菌对FQs耐药性相关的质粒.以工程菌E.coli DH5α为受体菌,采用氯化钙法制备感受态细胞,在含0.4μg/mL环丙沙星的LB平板上筛选转化子,并对转化子进行FQs等药物的耐药性检测.采用变温-SDS法进行转化子质粒的消除实验,结果发现传至第5代的耐药谱及质粒图谱变化很小,传代至第8代才发现有质粒带被消除,同时转化子对环丙沙星、氨苄西林、氯霉素、四环素、复方新诺明的耐药性也消失,提示这几种抗菌药物的耐药性是由质粒介导.采用PCR方法对多重耐药质粒上喹诺酮类药物相关耐药基因(gyrA和qnr基因)进行检测.提取转化子质粒DNA及供体菌质粒DNA,PCR方法扩增gyrA基因的喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR),采用常规的TA克隆测序,并与同菌株染色体上gyrA基因片段进行同源性比较.对猪场、鸡场分离的共256株FQs多重耐药大肠杆菌,采用水浴煮沸法提取模板DNA,先后试用三对引物,采用PCR方法进行qnr基因的检测,通过PCR产物的限制性内切酶pstI消化及PCR产物的直接测序,与GenBank登陆的qnr基因序列(Accession NoAY070135)比较分析,证实为非特异条带,未能成功获得qnr基因,可能方法不合适或实验菌株根本不存在该基因.

leecius

完全看不懂，呵呵