北京农学院生物技术系，北京 １０２２０６）
中图分类号：Ｓ８５９．７９６．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－９３８１（２００４）０７－００２３－０３
摘 要：建立了快速定量测定氯霉素（ＣＡＰ）含量的间接竞争酶联免疫吸附试验方法。游离氯霉素与氯霉素辣根过氧化物酶标记物（ＨＲＰ）在同一系统中竞争数量有限的氯霉素抗体结合位点，氯霉素酶标记物与氯霉素抗体结合的数量反比于游离氯霉素的数量。氯霉素浓度在０．２～２０ μｇ·ｍｌ－１范围内具有良好的线性关系, 回归方程为ｙ＝０．８３２７－０．５２６０ｘ，ｒ２＝０．９８６２；测定低限为２０ ｎｇ·ｍｌ－１；方法平均回收率为８３．５％，符合目前国际上氯霉素残留量检测的要求。
关键词：氯霉素残留；酶联免疫竞争法；兔肉
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ＣＡＰ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｍｅａｔ
Ｗａｎ Ｓｈａｎ－ｘｉａ Ｘｕ Ｘｉｕ－ｙｕａｎ Ｗａｎｇ Ｊｉａｎ－ｌｉ Ｚｈａｎｇ Ｓｈｕ－ｐｉｎ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｄｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ＢｅｉＪｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ,ＢｅｉＪｉｎｇ １０２２０６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＣＡＰ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｆｒｅｅ ＣＡＰ ａｎｄ ＣＡＰ－ＨＲＰ ａｒｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｔｏ ＣＡＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｙｓｔｅｍ． ＣＡＰ－ＨＲＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ ｉｓ ｉｎ ｉｎｖｅｒｓｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｔｏ ｆｒｅｅ ＣＡＰ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＡＰ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｆｒｏｍ ０．２～２０ μｇ·ｍｌ－１． Ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｗａｓ ｙ＝０．８３２７－０．５２６０ｘ, ｒ２＝０．９８６２． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｗａｓ ２０ ｎｇ·ｍｌ－１． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｗａｓ ８３．５．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ＣＡＰ；ＥＬＩＳＡ；ｒａｂｂｉｔ ｍｅａｔ
氯霉素（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏ１,ＣＡＰ）是对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有很好抑制作用的抗生素，氯霉素由于其优良的抗菌性、稳定的药性和廉价，曾在一段时期内作为饲料添加剂和细菌性疾病的治疗用药。但后来人们发现氯霉素对骨髓和新生儿有较大的毒性，易引起人体血中毒，导致不可逆的再生障碍性贫血等严重的毒副作用［１］，对人类的健康构成巨大的潜在威胁。因此，氯霉素残留问题引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。许多国家对在供人类食用的土畜产品、水产品中明令禁止使用氯霉素，严格规定了氯霉素的残留限量。我国农业部农牧发［１９９７］３号文件规定，在各种动物的可食性组织中，氯霉素被规定为不得检出药物（即零残留）；在畜产品质量监测中，氯霉素残留是必检项目。
目前，氯霉素残留分析主要采用高效液相色谱法和气相色谱法。高效液相色谱法虽操作简单，但检出限较高，无法满足当前对氯霉素低残留限量的要求。气相色谱法灵敏度较高,但样品前处理过程复杂、分析速度慢、仪器价格昂贵，不适合在基层推广使用。基于抗原抗体特异性反应建立起来的酶联免疫测定方法，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点，可以直接用于生产实践。在试验中以人工合成的氯霉素－牛血清白蛋白（ＣＡＰ－ＢＳＡ）为免疫原，得到抗血清经纯化后作为抗体，建立了间接竞争ＥＬＩＳＡ方法检测ＣＡＰ的标准曲线，并确定了该法用于检测ＣＡＰ的低限。该标准曲线的建立为动物性食品中ＣＡＰ残留ＥＬＩＳＡ检测试剂盒的研制与应用奠定了基础。
１ 材料与方法
1.1 仪器和试剂
美国Ｗａｔｅｒｓ公司高效液相色谱仪（附４８１型紫外检测器和Ｗａｔｅｒｓ ５１０泵），美国ＯＭＮＩ细胞匀浆机，美国Ｏｒｇａｎｏｍａｔｉｏｎ Ｎ－ＥＶＡＰ１２氮吹仪，上海亚荣生化仪器厂 ＲＥ－５２Ａ旋转蒸发仪，ＭｉｌｌｉＱ 系统（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ,曰本东京）超纯水器，５５０型微孔板判读仪（Ｂｉｏ－Ｒａｄ厂家），ＴＧＬＬ－１８Ｂ高速冷冻离心机（江苏太仓医疗仪器厂），微量加样器，微量多通道加样器，Ｃｏｓｔａｒ的酶标板。
乙酸乙酯（分析纯）、无水硫酸钠（分析纯）、正己烷（分析纯）、甲醇（ＨＰＬＣ级），氯霉素标准品（购自北京耀北生物技术有限公司，ＵＳＰ级，Ａｍｒｅｓｃｏ ０２３０ 分装）；辣根过氧化酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ＩｇＧ，工作效价２×１０３，（欣经科生物技术公司）；ＣＡＰ－ＢＳＡ及抗体自制［２，３］。
溶液系统：包被缓冲液，洗涤缓冲液，磷酸－柠檬酸底物缓冲液，底物溶液，终止液［４］。
1.2 检测方法
１．２．１ 氯霉素抗体间接竞争ＥＬＩＳＡ法的建立与方法特异性的考察
抗血清经过３５％饱和硫酸铵法盐析和ＤＥＡＥ－纤维素吸附纯化得到氯霉素多克隆抗体后,对各种ＥＬＩＳＡ法的工作条件（包被介质、反应介质、抗原和抗体最适使用浓度等）采用方阵滴定法进行筛选，选择氯霉素对抗原抗体结合反应抑制灵敏度高，且氯霉素空白对照Ｏ．Ｄ４９０为１．０，抗原和抗体用量均少的试验组合为试验最佳工作条件组合。在最佳工作条件下用ＥＬＩＳＡ法检测ＣＡＰ抗体与磺胺二甲嘧啶、氟哌酸、青霉素、链霉素交叉反应率。
包被原用包被液稀释成１ μｇ／ｍｌ加入酶标板，１００ μｌ／孔（以阴性血清作对照），４℃吸附过夜（或３７℃２ ｈ），滤纸吸干，洗板４次，加封闭液１５０ μｌ／孔，３７℃放置１ ｈ。滤纸吸干，洗板４次，４℃保存备用。将不同浓度的氯霉素标样（或样本）溶液分别与自制多抗稀释液４∶１混合后加入用抗原包被好的酶标板中，１００ μｌ／孔，以稀释液为对照，３７℃反应２ ｈ。滤纸吸干，洗板４次，加酶标二抗反应１ ｈ。滤纸吸干，洗板４次，加底物液１５０ μｌ／孔，３７℃反应２０ ｍｉｎ，加终止液５０ μｌ／孔，在酶标仪上测定光密度ＯＤ４９０。然后在优化条件下以各质量浓度ＣＡＰ（包括０ μｇ／ｍｌ）的ＯＤ４９０值转换成Ｂ／Ｂ１％，其中无ＣＡＰ抑制时的ＯＤ４９０值为Ｂ１，各相应质量浓度的ＣＡＰ抑制时的ＯＤ４９０值为Ｂ，因为Ｂ／Ｂ１％值与ＩｇＣＡＰ成线性回归关系，从而可计算回归曲线的方程与相关系数。在相同条件下，测定氯霉素和类似物与抗体的交叉反应率。交叉反应率越低,对氯霉素测定的干扰越小。
１．２．２ 样本的前处理
兔肉添加和提取方法均采用其常规残留测定方法，分别选择３个添加水平，另设一个空白样本，每个水平重复３次测定。样本的前处理方法如下：
采用间接竞争ＥＬＩＳＡ方法测残留的样品制备：取兔肉２０ ｇ，加４０ ｍｌ ０．０１ ｍｏｌ·Ｌ－１ ｐＨ７．４磷酸缓冲液，超声波提取１５ ｍｉｎ，室温静置３０ ｍｉｎ，取上清液，沉淀再用超声波重复提取两次，三次提取液合并，置４℃冰箱中备用。
采用液相色谱测定方法测残留的样品制备：称取５ ｇ肌肉组织和５ ｇ预先烘干的无水硫酸钠置于匀浆瓶中，并加入４０ ｍｌ乙酸乙酯，用细胞匀浆机将混合物进行均相化处理，以３ ０００ ｒ·ｍｉｎ－１的速度匀浆５ ｍｉｎ，然后过滤移出上清液，并转移至蒸馏烧瓶中，重复２次。合并后的萃取液用旋转蒸发仪在水浴４０℃条件下蒸发除去乙酸乙酯。在残留物中加入５ ｍｌ甲醇和５ ｍｌ正己烷，并转移至分液漏斗中进行振荡。然后弃去正己烷，再加入５ ｍｌ正己烷重复上述步骤。最后，使用氮吹仪在５０℃、干燥氮气流的作用下将甲醇相挥发至干，重新使之溶解于甲醇－水－冰醋酸 （５０∶５０∶０．１）溶液中，并通过０．４５ μｍ有机微孔滤膜过滤，滤液供ＨＰＬＣ用。
１．２．３ 测定方法样本经过前处理后，分别用ＥＬＩＳＡ方法和ＨＰＬＣ方法进行测定
采用所建立的ＥＬＩＳＡ方法：间接竞争性ＥＬＩＳＡ，操作方法同前１．２．１所述。
采用液相色谱测定方法：
色谱柱：Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８ ５ μｍ ２５０×４．６ ｍｍ；
预柱：内充Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋＣＬＣ－ＯＤＳ前置保护柱；
流动相：甲醇－水－冰醋酸 （５０∶５０∶０．１），经超声波脱气和０．４５ μｍ有机微孔滤膜处理；
流动相流速：１．０ ｍｌ·ｍｉｎ－１；
柱温：室温；
检测波长：２７８ ｎｍ；
进样量：２０ μｌ。
１．２．４ 氯霉素标准曲线绘制
间接竞争ＥＬＩＳＡ标准曲线绘制，依１．２．１建立ＥＬＩＳＡ标准曲线。
液相色谱测定方法标准曲线绘制如下：制备０．１，０．２，０．５，１．０，１．５，２．０ μｇ·ｍｌ－１的标准溶液系列，在上述色谱条件下分别取２０ μｌ标
准溶液进样进行测定，按标准曲线外标法用峰面积进行定量计算。
１．２．５ 回收率测定
依１．２．１步骤，测定按不同程序提取的氯霉素标准添加样本溶液，对抗原抗体结合反应的抑制率，根据平行试验所得工作曲线计算氯霉素含量，实测量占添加量的百分率为回收率。试验重复３次。
１．２．６ ＨＰＬＣ法对ＥＬＩＳＡ法测定结果的验证
经一系列试验优化ＨＰＬＣ条件后，测定平行提取的标准添加肉样中氯霉素含量，氯霉素标样浓度设置为４，２０，１００，５００，２ ５００ ｎｇ·ｍｌ－１，按工作曲线法计算标准添加回收率；与平行进行的ＥＬＩＳＡ法测定结果进行比较验证。
２ 结果分析
2.1 氯霉素ELISA分析标准曲线及方法的特异性
氯霉素分析标准曲线见图１。从图１可以看出，自制抗体间接竞争ＥＬＩＳＡ法，测定氯霉素对抗原抗体结合反应产生抑制的线性浓度范围为１～１０３ ｎｇ·ｍｌ－１。从图１可知，在０．２～２０ μｇ·ｍｌ－１之间，曲线呈良好的线性关系，且此段曲线的斜率较大，故最适检测范围为０．２～２０ μｇ·ｍｌ－１，最低检测限为０．０２ μｇ·ｍｌ－１。根据Ｂ／Ｂ１％,再对ＩｇＣＡＰ进行回归分析，得到回归方程为ｙ＝０．８３２７－０．５２６０ｘ，ｒ２＝０．９８６２。磺胺二甲嘧啶、氟哌酸、青霉素、链霉素与抗体的交叉反应率均＜０．０１％，不干扰氯霉素残留的分析，结果见表１。
2.2 回收率与精密度
以未检出氯霉素的家兔肌肉样品做加标回收实验，分别加入浓度为０．０５，０．１，１．０ μｇ·ｍｌ－１氯霉素标准液１ ｍｌ，放置２ ｈ，使药物充分渗入组织，按样品前处理方法处理后测定，所得平均值与将标准液直接测得的平均值之比，即为氯霉素的回收率。测定结果如表２所示。氯霉素平均回收率为８３．５％，表明此方法回收率很好。
2.3 兔肉中氯霉素含量ELISA与HPLC分析结果的比较
按程序１．２．１与１．２．２提取净化的方法添加兔肉样本，按１．２．３ＨＰＬＣ条件进行测定，氯霉素色谱以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，线性回归方程为：ｙ＝１３０ ８７５ｘ－４５４２．１ Ｒ＝０．９９９６，检测限１０ ｎｇ·ｍｌ－１。ＨＰＬＣ法和ＥＬＩＳＡ法测定标准添加回收率结果见表２。
表２表明：ＥＬＩＳＡ法测定氯霉素的标准添加回收率＞８０％，与ＨＰＬＣ法分析结果基本吻合，方法的准确度和精密度符合残留分析的要求。
３ 讨论
以上数据表明，氯霉素的ＥＬＩＳＡ分析方法与ＨＰＬＣ分析方法的添加回收率基本吻合，符合残留分析的要求。在酶联免疫分析中，由于其很高的检测特异性，一般对分析样本的前处理要求较低，对样本适应性强。但在取样量较大时，有些复杂基质的共提物也会影响测定，造成非特异性结合，形成空白干扰。为了保证方法测定的灵敏度，有时也要采取一些简便的前处理手段以排除干扰，有时为了避免干扰适当地减少取样量，同时也导致测定灵敏度的降低。但ＥＬＩＳＡ法具有特异性强、简便快捷、分析成本低、样品容量大、不需要贵重仪器等优点，可作为氯霉素残留快速测定方法加以开发利用，酶联免疫检测试剂盒可用于氯霉素残留现状调查及分析。
参考文献
［１］关嵘．应用酶联免疫技术检测动物源性食品中氯霉素残留的研究［Ｊ］．检验检疫科学,２００２,１２（４）：５－１０．
［２］王桂枝，石德时，毕丁仁，等．氯霉素免疫原的合成与鉴定［Ｊ］．中国兽医学报，１９９８，１８（３）：１６３－１６７．
［３］覃雅丽，石德时，王桂枝，等．抗氯霉素单克隆抗体的制备及鉴定［Ｊ］．中国兽医学报，２００１，２１（６）：５５６－５５８．
［４］周顺伍．动物生物化学实验指导（第二版）［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００２．１６９－１７０．
（作者 万善霞 徐修远 王建立 张淑萍）
作者简介：万善霞，女，硕士，讲师，主要从事动物生理生化的教学和科研工作。
基金项目：农业应用新技术北京市重点实验室开放课题（２００２－０３）。
收稿曰期：２００４－０５－２３
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发表于 2006-5-31 22:16:18
