免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响

薛家宾

免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响
薛家宾，杨龙圣，徐为中，胡元亮
9 S- c7 S8 Z4 H) n) j0 v, p兔病毒性出血症是由兔出血症病毒（RHDV）引起的兔的一种急性、高度接触性传染病该病呈爆发性流行，发病率死亡率极高，给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒主要感染2月龄以上青壮年兔，2月龄以内兔具有一定抵抗力[2]，未断乳兔很少发病[1]，或者感染后只有轻微症状[3]。但是近年来，不时有关于幼兔爆发兔病毒性出血症病的情况发生[4～7]，本病的流行和发病特点有向幼龄化变化的趋向[8]。因此，通过幼兔免疫反应的规律的研究对于找到合理的幼兔兔病毒性出血症疫苗免疫程序具有重要的指导意义。本试验研究了日龄与抗体产生之间的关系，旨在揭示不同日龄幼兔对疫苗的抗体反应规律，为制定合理的免疫程序提供理论依据。
1 材料与方法
& d! t( u1 [" y, b6 w( P& }1.1 材料
非免疫新西兰肉兔，由江苏省农科院兽医研究所实验动物中心提供。兔病毒性出血症组织灭活疫苗、兔病毒性出血症抗原（RHDV）、兔病毒性出血症阳性血清、兔病毒性出血症阴性血清，均由江苏省农业科学院兽医研究所提供。人“O”型血，由南京军区总医院提供。
TGL-16G型台式高速离心机，上海医用分析仪器厂生产；WMK-2型恒温箱，南京试验仪器厂生产；100µl移液枪，eppendorf公司生产；大孔U型血凝板。
9 B/ o8 m' C* x  a# v" i1.2 攻毒试验
5 b$ m' |* o# c. Q" c选取免疫前后HI抗体效价分别为0、1、2、3、4的家兔各6只，分别注射HA为3的RHDV液1ml攻毒，记录死亡时间、剖检病变，并进行兔出血症鉴定，比较不同HI效价水平的保护率。
7 s% f3 O2 Z2 t5 P. Z, c1.3母源抗体水平的测定
1 _! f: ]* Y1 ]9 {1 d! o取30、35、40、45、50、55和60日龄的新西兰兔各4只，耳缘静脉采血，分离血清，56℃水浴锅内灭活30min，测定母源抗体效价
1.4 免疫试验
取1.3家兔，分别颈部皮下注射兔病毒性出血症灭活疫苗1mL免疫。分别于免疫1～8周同法采血、测定免疫后抗体效价的动态变化。
1.5 抗体效价测定方法
7 H, {; p) G1 z9 ~8 A用微量血凝抑制（HI）法 [9]。取待检血清50µl，在血凝板上用等量生理盐水倍比稀释6个梯度，每孔加入4单位血凝病毒，37℃感作30min，加入等量的1％新鲜人“O”型红细胞，4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清对照。测定重复3次，结果以平均数±标准差表示，用SPSS软件统计分析。
" ]2 N( s% v, @( v5 R( e5 C2 结果与分析
2.1 不同抗体效价水平的保护效果
4 r9 F# i# ^1 i2 U6 X7 s# l抗体效价高于3 log2时可产生100％的保护，2 log2的保护率仅为50％，2 log2以下时，无保护效果（表1）。
表1 不同抗体效价水平的保护效果
Table 1  Protective effect of different antibody titer
# V3 O$ u) B9 j4 ?4 _7 k( J" `抗体效价（log2）        攻毒数         死亡数        存活数        保护率
" s. f; Y4 P+ [! ?* K0        6        6        0        0％
1        6        6        0        0％
2        6        3        3        50％
5 p( O" k1 F: x0 w2 t6 q& \3        6        0        6        100％
4        6        0        6        100％
2.2 母源抗体效价的动态变化
30日龄的母源抗体最高，为3.25 log2，可以产生有效的保护。以后随日龄增大逐步下降，35日龄下降到2.5 log2，可达到50％的保护，40～60日龄仅有0.25～1.25 log2（图1）。

( l, u  t- Z( N! m图1  母源抗体效价的动态变化
  D2 W( w" v( l! LFig 1  The dynamic variation of mother-source antibody titer
2.2免疫后抗体效价的动态变化
30日龄免疫，抗体效价不但不升、反而显著下降，基本无保护作用；35日龄免疫，抗体峰值较低较短，仅为3.25 log2，有效保护时间较短，仅为2周；40、45日龄免疫，抗体峰值升高到5.5 log2以上，有效保护时间达5周；50、55、60日龄免疫，抗体峰值达到6.25 log2以上，有效保护时间达7周（表2）。
  E5 V0 v$ {, `6 X9 R, }5 V表2 免疫后抗体效价的动态变化
+ E) G- _+ P1 o8 B% oTable 2  The dynamic variation of antibody titer after vaccination
: l7 O9 M7 r, c: H. U! X免疫日龄        免疫后
1 a! e/ z# q& j/ J        1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周        8周
30        1.67±0.58c        2.75±0.96bc        1.75±0.96b        1.00±0.00d        0.25±0.50c        0.13±0.25c        0.000±0.00d        0.000±0.00d
35        3.25±0.50ab        3.00±0.82bc        2.38±0.49b        2.00±0.00c        1.00±0.00c        0.75±0.50c        0.00±0.00d        0.00±0.00d
40        3.00±0.82ab        5.75±1.71a        5.00±1.83a        3.25±1.50b        3.00±0.82b        2.13±0.50b        1.83±0.58bc        1.03±0.63bc
# q( }8 L8 h, v, n# U4 M  n45        3.25±1.26ab        4.25±0.96ab        5.50±1.29a        3.75±0.96b        3.25±1.26b        2.38±1.80b        2.00±1.41bc        1.13±0.63bc
50        2.25±0.50bc        4.25±0.96ab        4.50±2.08a        5.75±0.50a        6.00±0.00a        5.00±0.00a        3.5±0.58ab        1.50±0.58b
  {2 m+ w; K2 q# r0 ~55        3.50±0.58a        4.75±0.50a        6.00±0.82b        5.75±1.50a        5.25±0.96a        4.25±0.50a        3.25±0.96b        2.75±1.26ab
60        3.50±0.58a        5.00±0.82a        6.25±0.50a        5.75±0.96a        5.00±0.82a        4.13±0.85a        3.25±0.96b        2.25±0.96b
注:同列数据不同字母者差异显著(p<0.05)。
, v3 Z, [" C. @Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.
3 讨论
4 ^  p0 g, c1 j" W% |& h3.1母源抗体与保护率的关系
3 d- {! k2 F: S* r0 X% \幼兔出生之后,其体内兔病毒性出血症母源抗体可通过胎盘和初乳两个途径获得[10], 初生乳兔在5~10日龄内其血清中兔病毒性出血症抗体HI效价与免疫母兔相当,之后幼兔血清抗体水平迅速下降[11]。本实验结果表明，HI效价为3 log2时，可抵抗RHDV强毒攻击，可将3 log2定为RHD的有效保护效价；母源抗体与日龄呈负相关，30日龄的母源抗体最高，可以产生有效的保护，这也可能是幼兔RHD发生较少的原因之一；到35日龄，母源抗体下降到2.5 log2，仅有50％的保护，此后的母源抗体水平已很难抵抗RHDV的攻击。
$ I% {( ?1 _. S8 H: G  T* j, j' b3.2 免疫日龄对抗体峰值和有效保护时间的影响
& C3 F4 P1 N& o6 ^: V1 K, m免疫结果表明，免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关，30日龄免疫，抗体效价不但不升、反而显著下降，无保护作用，可能由于母源抗体以及幼兔免疫系统发育不成熟等原因引起[12]；35日龄免疫，抗体峰值较低，有效保护时间2周；40、45日龄免疫，抗体显著升高，峰值达5.5 log2以上，有效保护时间5周；50、55、60日龄免疫，抗体峰值6.25 log2以上，有效保护时间7周。但是近年来，兔病毒性出血症的发病出现幼龄化，40日龄兔的发病率达83.3％[13]，因此必须选择合适的免疫日龄以减少RHD的发生。

小苏

看不懂呀，麻凡老师给我免疫程序表

豆芽儿

能不能写点可以让我们消化的东西啊，太深奥了，

薛家宾

查看本专区的内容，有免疫程序可供参考。

leecius

薛老师的意思是不是虽然从理论上说50-60日龄免疫的效果最好，但因为此病有幼化的趋势，所以要在35日龄免疫，最好在50-60日龄再加强免疫一次

chnrabbit

这篇文章我很早就拜读了，很好，对于我们制定兔子的免疫程序有很大的帮助，强烈支持。

  K$ ?7 n8 |! s) p: \
1 R0 J$ ^- Q5 Q" y

# z- n1 K" U4 y- @

免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响

' |. |; p! Y  a, ?' s% w8 R

薛家宾，杨龙圣，徐为中，胡元亮

(1江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京210014；2．南京农业大学动物医学院。江苏南京210095)

9 H; }% {. r( o; z! [9 ?

摘要：通过攻毒试验比较了新西兰家兔免疫前后0、1、2、3和4 log：5种抗体水平埘病毒性出血症(RHD)的保护效果，同时测定了30、35、4O、45、50、55和60日龄非免疫兔的母源抗体效价和用RHD组织灭活占免疫后8周内血清抗体效价的动态变化。结果表明，抗体效价高于3 log：时可产生100％的保护，2 l0g 的保护率仅为50％；母源抗体与日龄呈负相关，在30日龄时最高，可以产生有效的保护，在40日龄后已无保护作用；免疫日龄与抗体峰值和有效保护时间呈正相关，30日龄免疫，抗体效价不但不升，反而显著下降，无保护作用；35日龄免疫，抗体峰值较低，有效保护时间仅为2周；大于40日龄免疫，抗体峰值较高，有效保护时间延长。因此建议35日龄首免、2周后二免为最佳免疫程序。

2 L9 J1 h4 i  Y8 G) J  |  V

关键词：兔病毒性出血症；免疫日龄；抗体效价；有效保护时间

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血症病毒(RHD virus，RHDV)引起的家兔的一种急性、高度接触性传染病，常呈暴发性流行，发病率和死亡率极高，给养兔业造成极大的经济损失.。本病主要感染2月龄以上青壮年兔，2月龄以内兔具有一定抵抗力J，未断乳兔很少发病l】J，或感染后只有轻微症状。但是近年来，本病的流行和发病特点趋向于幼龄化J，幼兔暴发疫情时有发生J，因此，寻找合理的免疫程序或理想的疫苗具有重要意义。本研究首先通过攻毒试验比较了新西兰家兔免疫前后0、l、2、3和4 log 5种抗体水平对RHD的保护效果，同时测定了30、35、40、45、50、55和60日龄非免疫兔的母源抗体效价和用RHD组织灭活苗免疫后8周内血清抗体效价的动态变化，旨在探讨抗体水平对保护效果的影响、母源抗体的消长规律、免疫日龄与抗体峰值和有效保护时间的关系，为选择免疫注射的最低日龄、制定合理的免疫程序提供理论依据。

2 z$ l. [: }( Y. V" @

1 材料与方法

1．1 材料

6 w2 Q1 V# x2 [$ @

非免疫新西兰肉兔，由江苏省农业科学院兽医研究所实验动物中心提供。兔病毒性出血症组织灭活疫苗、兔病毒性出血症抗原(RHDV)、兔病毒性出血症阳性血清、兔病毒性出血症阴性血清，均由江苏省农业科学院兽医研究所提供。人“0”型血，由南京军区总医院提供。

TGL一16G型台式高速离心机，上海医用分析

仪器厂生产；WMK一2型恒温箱，南京试验仪器厂

生产；100 HI移液枪，Eppendorf公司生产；大孔U型

血凝板。

1．2 攻毒试验

# |6 `! e. X$ x8 ]

选取免疫前后HI抗体效价分别为0、l、2、3、4的家兔各6只，分别注射HA为3的RHDV液l ml攻毒，记录死亡时间、剖检病变，并进行兔出血症鉴定，比较不同Ⅲ 效价水平的保护率。

2 \4 a7 i4 F- s. l/ A

1．3 母源抗体水平的测定

取30、35、40、45、50、55和60日龄的新西兰兔各4只，耳缘静脉采血，分离血清，56。二水浴锅内灭活30 min，测定母源抗体效价。

1．4 免疫试验

+ D% I; ~% F1 m$ Q* q* E: e

取1．3所述家兔，分别颈部皮下注射兔病毒性出血症灭活疫苗1 m1免疫。分别于免疫1～8周同法采血、测定免疫后抗体效价的动态变化。

, v4 f+ z1 {+ ^. I5 s0 K; {

1．5 抗体效价测定方法

) J1 {. K4 }5 N, T+ o4 c  q( ]% ?

用微量血凝抑制(HI)法J。取待检血清50，在血凝板上用等量生理盐水倍比稀释6个梯度，每孔加入4单位血凝病毒，37℃感作30 min，加入等量的1％新鲜人“0”型红细胞，4℃感作30 min，观察结果。同时设阳性血清和阴性血清对照。测定重复3次，结果以平均数±标准差表示，用SPSS软件统计分析。

2 结果与分析

$ W  P- ?5 N; l1 s  R5 h* n

2．1 不同抗体效价水平的保护效果

$ N# D+ p5 G/ J

抗体效价高于3 log 时可产生100％的保护，效价为2 log 的保护率仅为50％ ，效价在2 log 以下时，无保护效果(表1)。

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学无止境

肉兔出栏时间短，也得打两次兔病毒性出血症疫苗呀！

yaoshengtuye

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看看再说

泰山养兔人

2.1 不同抗体效价水平的保护效果（表1）
% H( ~0 e( A9 J1 ?

抗体效价（log2）	攻毒数	死亡数 & I/ k% D0 [" f) P	存活数 # N! \8 y0 M% R0 A	保护率%
0 6 M6 r# X& @& p, F7 g4 A1 M- g	6 ; Y  a' J, h; S1 O	6 $ o6 S) B9 k/ ^" h	0	0 2 n5 G3 y9 A7 ^! ?
1 ' z6 M8 i9 i( r, r9 _! n3 k! x	6	6 + M9 O2 d. a/ A0 G, S	0	0
2	6	3 : G5 G6 Q! f. l- T) Z2 R3 n2 z) F; a	3	50 # S5 ~) n" o- H  d; f& K! q/ [
3 " F6 u0 Y6 }0 p2 p  I8 Z4 m9 ~	6	0	6 * Z' o- \% t  p4 k, _9 ^' X, q) T/ z	100 ; y  R. v0 X# Y) |, U# d8 Y
4	6	0 1 \3 u0 v) V- q	6 + u& X( X' w2 Z2 z$ o* J6 z	100

表2 免疫后抗体效价的动态变化中国最大的畜牧养兔信息平台3 U. d% \8 a1 a" y! b: P" v
      
2 j9 \8 F4 Y/ c3 j9 r

; \( |2 I9 l8 o7 T日龄 - p7 Q$ J% Q* Q7 ^# A	免疫后 3 {( G: J; `7 C+ \$ q  g: I0 q
	1周	2周 7 J& A- y3 `4 O9 z! E7 V4 `2 r8 X" B	3周 7 Z6 s0 }7 P1 U1 `! T6 j  I	4周	5周 5 c  J) V2 l! W2 [' O) s# Y) v	6周 5 P* y. }/ s! c6 w. U% [5 Z0 G2 S	7周 : h/ p3 `# M8 i5 m	8周
30	1.67±0.58c / {( r& c, P2 v( d* n1 @' m	2.75±0.96bc	1.75±0.96b ; J# M+ D( \* ?7 f5 Y0 Y	1.00±0.00d 0 g6 Z5 g- F8 g	0.25±0.50c	0.13±0.25c	0 3 E& m5 h$ ~7 |; i$ u/ d	0 6 d, P8 y& _$ V% j1 A
35	3.25±0.50ab	3.00±0.82bc 5 W4 i% s1 h3 g) V5 w: l/ i1 }	2.38±0.49b ! N) n* t2 m; L2 Z' S6 \: s	2.00±0.00c ! S1 v; {" N9 a+ p) s	1.00±0.00c	0.75±0.50c - }7 h  O1 ^+ @/ l+ N2 S	0 6 f6 c4 t9 C. n, J$ Y; X	0
40	3.00±0.82ab 4 P' e+ }/ d% I% I' X	5.75±1.71a 0 i2 _! K  }0 |; R. _- X* M5 X	5.00±1.83a	3.25±1.50b * [5 I9 G- ^8 l$ P0 T9 K$ m2 y	3.00±0.82b	2.13±0.50b # @1 Z8 Q9 Q" S2 L) m3 S	1.83±0.58bc $ b6 y# [- |; ]. u3 [& f7 s	1.03±0.63bc
45 ) Y5 x) r4 b. K6 i) e	3.25±1.26ab	4.25±0.96ab	5.50±1.29a % E" S+ J/ M5 ^	3.75±0.96b	3.25±1.26b	2.38±1.80b 7 I: j; p  M- i	2.00±1.41bc	1.13±0.63bc 8 ~" ]- Z6 T8 W% s* p! O3 P( f
50	2.25±0.50bc	4.25±0.96ab	4.50±2.08a 3 @  R1 O6 y, ?- l, F	5.75±0.50a	6.00±0.00a	5.00±0.00a	3.5±0.58ab	1.50±0.58b
55 ( S4 E5 c4 b0 c7 J  U2 J# M	3.50±0.58a % b7 ]- v8 }! w' e+ X/ y; D	4.75±0.50a	6.00±0.82b	5.75±1.50a	5.25±0.96a	4.25±0.50a	3.25±0.96b ; u% T2 |8 Z+ j, }$ y% H! r7 W1 _	2.75±1.26ab
60	3.50±0.58a 7 e$ J8 S# T' L0 J9 M	5.00±0.82a 2 K& Y/ E8 v! ~4 J	6.25±0.50a	5.75±0.96a , c0 H! V  z0 B: R8 i	5.00±0.82a	4.13±0.85a   y4 E/ `' A+ V, C  f	3.25±0.96b	2.25±0.96b

注:同列数据不同字母者差异显著(p<0.05)。
. t' {2 g' P: `' z, T: i
( S$ t8 O5 X  y, v3 Z# h$ `( X& w

) z/ m" {9 }, W$ D8 Y
   薛教授的表格发上来可能格式不合适，显示不清楚，我修改了下发上给大家看看。

[ 本帖最后由 泰山养兔人 于 2008-4-9 08:10 编辑 ]

薛家宾

请查阅本专区内有关家兔免疫程序中的“肉兔免疫程序”。

健康兔

看看再说

郭鉴

在我记得，关于研究首免最佳时间发展史是：
45日龄
30日龄
30－40日龄，即35日龄+-5
" O  F0 l% M5 _2 c+ _现在－－－“30日龄免疫，抗体效价不但不升、反而显著下降，无保护作用，可能由于母源抗体以及幼兔免疫系统发育不成熟等原因引起[12]；35日龄免疫，抗体峰值较低，有效保护时间2周；40、45日龄免疫，抗体显著升高，峰值达5.5 log2以上，有效保护时间5周；50、55、60日龄免疫，抗体峰值6.25 log2以上，有效保护时间7周。”
3 P2 W+ J0 i; v+ W一直很关心这个问题，现有几个问题我不太明白，想和大家探讨：
1、母兔抗体水平决定仔兔母源抗体水平，不同论文中测定这些数据时母兔抗体水平是否一样？母兔抗体水平（或各）处于什么状态？
2、“30日龄的母源抗体最高，为3.25 log2”，是在母兔抗体水平最高测得的吗？此时母兔抗体处于什么水平？
" c9 x  r0 {5 a3、论文中“40～60日龄仅有0.25～1.25 log2”，“40、45日龄免疫，抗体峰值升高到5.5 log2以上，有效保护时间达5周；50、55、60日龄免疫，抗体峰值达到6.25 log2以上，有效保护时间达7周”。也就是说母源抗体水平为0.25～1.25 log2是免疫，就会获得良好的免疫效果，对吗？
4、决定母源抗体水平为0.25～1.25 log2有两个主要因素，一个是幼兔日龄，一个是母兔抗体水平。那么，当母兔抗体水平在各个水平阶段时，要达到母源抗体水平为0.25～1.25 log2,幼兔的日龄段分别是多少？
5、母兔抗体水平用上次免疫以后的周数表示，虽然不够精确，但更接近于实践。大家说对不？

[ 本帖最后由 郭鉴 于 2008-4-25 12:42 编辑 ]

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看看

蒲皮皮