免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响

薛家宾 · 发表于 2008-1-31 16:32:15

免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响
薛家宾，杨龙圣，徐为中，胡元亮
兔病毒性出血症是由兔出血症病毒（RHDV）引起的兔的一种急性、高度接触性传染病该病呈爆发性流行，发病率死亡率极高，给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒主要感染2月龄以上青壮年兔，2月龄以内兔具有一定抵抗力[2]，未断乳兔很少发病[1]，或者感染后只有轻微症状[3]。但是近年来，不时有关于幼兔爆发兔病毒性出血症病的情况发生[4～7]，本病的流行和发病特点有向幼龄化变化的趋向[8]。因此，通过幼兔免疫反应的规律的研究对于找到合理的幼兔兔病毒性出血症疫苗免疫程序具有重要的指导意义。本试验研究了日龄与抗体产生之间的关系，旨在揭示不同日龄幼兔对疫苗的抗体反应规律，为制定合理的免疫程序提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
非免疫新西兰肉兔，由江苏省农科院兽医研究所实验动物中心提供。兔病毒性出血症组织灭活疫苗、兔病毒性出血症抗原（RHDV）、兔病毒性出血症阳性血清、兔病毒性出血症阴性血清，均由江苏省农业科学院兽医研究所提供。人“O”型血，由南京军区总医院提供。
TGL-16G型台式高速离心机，上海医用分析仪器厂生产；WMK-2型恒温箱，南京试验仪器厂生产；100µl移液枪，eppendorf公司生产；大孔U型血凝板。
1.2 攻毒试验
选取免疫前后HI抗体效价分别为0、1、2、3、4的家兔各6只，分别注射HA为3的RHDV液1ml攻毒，记录死亡时间、剖检病变，并进行兔出血症鉴定，比较不同HI效价水平的保护率。
1.3母源抗体水平的测定
取30、35、40、45、50、55和60日龄的新西兰兔各4只，耳缘静脉采血，分离血清，56℃水浴锅内灭活30min，测定母源抗体效价
1.4 免疫试验
取1.3家兔，分别颈部皮下注射兔病毒性出血症灭活疫苗1mL免疫。分别于免疫1～8周同法采血、测定免疫后抗体效价的动态变化。
1.5 抗体效价测定方法
用微量血凝抑制（HI）法 [9]。取待检血清50µl，在血凝板上用等量生理盐水倍比稀释6个梯度，每孔加入4单位血凝病毒，37℃感作30min，加入等量的1％新鲜人“O”型红细胞，4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清对照。测定重复3次，结果以平均数±标准差表示，用SPSS软件统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同抗体效价水平的保护效果
抗体效价高于3 log2时可产生100％的保护，2 log2的保护率仅为50％，2 log2以下时，无保护效果（表1）。
表1 不同抗体效价水平的保护效果
Table 1  Protective effect of different antibody titer
抗体效价（log2）攻毒数    死亡数存活数保护率
0 6 6 0 0％
1 6 6 0 0％
2 6 3 3 50％
3 6 0 6 100％
4 6 0 6 100％
2.2 母源抗体效价的动态变化
30日龄的母源抗体最高，为3.25 log2，可以产生有效的保护。以后随日龄增大逐步下降，35日龄下降到2.5 log2，可达到50％的保护，40～60日龄仅有0.25～1.25 log2（图1）。

图1  母源抗体效价的动态变化
Fig 1  The dynamic variation of mother-source antibody titer
2.2免疫后抗体效价的动态变化
30日龄免疫，抗体效价不但不升、反而显著下降，基本无保护作用；35日龄免疫，抗体峰值较低较短，仅为3.25 log2，有效保护时间较短，仅为2周；40、45日龄免疫，抗体峰值升高到5.5 log2以上，有效保护时间达5周；50、55、60日龄免疫，抗体峰值达到6.25 log2以上，有效保护时间达7周（表2）。
表2 免疫后抗体效价的动态变化
Table 2  The dynamic variation of antibody titer after vaccination
免疫日龄免疫后
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周
30 1.67±0.58c 2.75±0.96bc 1.75±0.96b 1.00±0.00d 0.25±0.50c 0.13±0.25c 0.000±0.00d 0.000±0.00d
35 3.25±0.50ab 3.00±0.82bc 2.38±0.49b 2.00±0.00c 1.00±0.00c 0.75±0.50c 0.00±0.00d 0.00±0.00d
40 3.00±0.82ab 5.75±1.71a 5.00±1.83a 3.25±1.50b 3.00±0.82b 2.13±0.50b 1.83±0.58bc 1.03±0.63bc
45 3.25±1.26ab 4.25±0.96ab 5.50±1.29a 3.75±0.96b 3.25±1.26b 2.38±1.80b 2.00±1.41bc 1.13±0.63bc
50 2.25±0.50bc 4.25±0.96ab 4.50±2.08a 5.75±0.50a 6.00±0.00a 5.00±0.00a 3.5±0.58ab 1.50±0.58b
55 3.50±0.58a 4.75±0.50a 6.00±0.82b 5.75±1.50a 5.25±0.96a 4.25±0.50a 3.25±0.96b 2.75±1.26ab
60 3.50±0.58a 5.00±0.82a 6.25±0.50a 5.75±0.96a 5.00±0.82a 4.13±0.85a 3.25±0.96b 2.25±0.96b
注:同列数据不同字母者差异显著(p<0.05)。
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.
3 讨论
3.1母源抗体与保护率的关系
幼兔出生之后,其体内兔病毒性出血症母源抗体可通过胎盘和初乳两个途径获得[10], 初生乳兔在5~10日龄内其血清中兔病毒性出血症抗体HI效价与免疫母兔相当,之后幼兔血清抗体水平迅速下降[11]。本实验结果表明，HI效价为3 log2时，可抵抗RHDV强毒攻击，可将3 log2定为RHD的有效保护效价；母源抗体与日龄呈负相关，30日龄的母源抗体最高，可以产生有效的保护，这也可能是幼兔RHD发生较少的原因之一；到35日龄，母源抗体下降到2.5 log2，仅有50％的保护，此后的母源抗体水平已很难抵抗RHDV的攻击。
3.2 免疫日龄对抗体峰值和有效保护时间的影响
免疫结果表明，免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关，30日龄免疫，抗体效价不但不升、反而显著下降，无保护作用，可能由于母源抗体以及幼兔免疫系统发育不成熟等原因引起[12]；35日龄免疫，抗体峰值较低，有效保护时间2周；40、45日龄免疫，抗体显著升高，峰值达5.5 log2以上，有效保护时间5周；50、55、60日龄免疫，抗体峰值6.25 log2以上，有效保护时间7周。但是近年来，兔病毒性出血症的发病出现幼龄化，40日龄兔的发病率达83.3％[13]，因此必须选择合适的免疫日龄以减少RHD的发生。