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幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究

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发表于 2008-1-31 16:24:05 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式
幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究' H, Z$ m+ H# D  R8 n6 k/ n" i8 I) {
杨龙圣,薛家宾,徐为中,胡元亮
7 _0 H6 k/ c) t; W% h% G# t$ t! e& W0 q( |1 T
兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(RHD virus,RHDV)引起的家兔的一种急性、高度接触性传染病,常呈爆发性流行,发病率和死亡率极高,给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒(RHDV)对青年、成年兔致病高,对二月龄以下幼兔一般不感染发病[1~3]。近年来的幼兔发生兔出血症逐渐增多[4~6],一些学者认为初免日龄在45日龄左右为宜,最好是用兔瘟单苗加倍免疫注射,60日龄左右再加强免疫一次[7]。而一部分养殖单位在仔兔断奶前后(30-35日龄)就免疫兔瘟苗,仅用单倍剂量,不再加强免疫,有时会发生免疫注射兔瘟苗后仍然发生兔瘟病[8][9]。为探明免疫注射后仍然发病的根源,进行了本试验研究。旨在通过免疫日龄及剂量与抗体产生之间的关系研究,明确幼兔兔瘟苗免疫的客观规律。
5 l0 Q3 E# C0 v+ }# C) r6 ^1 材料与方法$ n2 O/ X# M% ~: h; N7 |! Q. T
1.1 材料
' X* l* y) D  \. i9 P新西兰兔,35、40、45日龄。兔病毒性出血症组织灭活疫苗(批号20041201),阳性血清,阴性血清,兔出血症病毒(RHDV,皖阜株)均由江苏省农业科学院兽医研究所提供;人“O”型红细胞,由南京军区总医院提供。  ?- k, p& Q7 h$ e
TGL-16G台式高速离心机,由上海医用分析仪器厂生产;WMK-2型37℃恒温箱,南京试验仪器厂;100µl移液枪,eppendorf公司生产;50孔U型血凝板。
7 s/ z: O2 W, s. H0 n1 l1.2 动物分组与血样处理/ {" w# ]5 r3 R, O
分别取35、40、45日龄幼兔各30只,每个日龄组分不免疫、免疫剂量1、免疫剂量2、免疫剂量3、免疫剂量4五个处理组,共15组,每个剂量组6只幼兔,颈部皮下注射兔瘟疫苗。注射疫苗后,每周1次耳静脉或心脏采血。血液置37℃温箱内1小时,10000rpm/min离心10min,吸取上清。血清置56℃水浴锅内30min后,用于测定抗体效价。# u6 P7 y* j: G4 [1 f
1.3 兔瘟抗体效价的测定
, ~3 v" M9 w/ `微量血凝抑制试验(HI)方法检测兔瘟抗体[10]。取50µl待检血清用等量生理盐水进行倍比稀释6个梯度,分别在每孔加入等量的4单位血凝病毒,37℃感作30min,加入等量的1%人“O”型红细胞,4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清作为对照。结果以平均数±标准差表示,用SPSS软件从剂量和日龄两个角度作统计分析。- e) D7 V. a2 x# n) H9 S
2 结果与分析( \3 }. Z* f3 ?
2.1 35日龄不同剂量组的抗体效价2 H; L& V, k9 s0 @: [% j- b/ ~2 T
35日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4后,其抗体产生速度较剂量1组快,剂量2、3、4组抗体效价一直显著高于剂量1组,剂量2、3、4组抗体效价峰值5.83显著高于剂量1组峰值3.25,有效抗体维持时间(>7周)大于剂量1组的2周。35日龄组幼兔剂量2、3、4组之间抗体产生速度、峰值、维持时间均无显著差异(表1)4 Z, a  c& p, V, h( w0 J: U. H
表1  35日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化) v$ b- {0 D8 R# n
Table 1. Diversification of the antibody of the 35 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine* b! B! E- f6 R- r
免疫
7 G, M' A5 f1 d! v剂量        免疫前        免疫后$ N' }- W& U3 I$ u) m6 u
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周) i+ e3 n3 T( g2 u& V
0        2.50±0.41        1.25±0.95b        1.00±0.82c        0.75±0.96c        0.25±0.50d        0.25±0.50d        0.00±0.00d        0.00±0.00c; ~- p! V& a& i
1        2.50±0.41        3.25±0.50a        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00c        1.00±0.00c        0.75±0.50c        0.00±0.00c
4 b" T9 H6 W8 f3 e8 D: |# e3 o2        2.00±1.00        4.00±0.00a        4.66±0.58a        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71b        4.50±0.73ab        4.50±0.53a
, L  t( s+ P* s5 H8 w$ v+ s, K! X3        2.00±1.00        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00b        5.25±0.35ab        4.25±0.23b        4.00±0.34b, [4 a. R' B% z0 H2 @
4        2.33±0.58        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.83±0.29a        5.50±0.00a        4.75±0.56a        4.33±0.26ab' I( a2 C8 @; ?! n1 y
注:同列数据标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)。以下数据同。! E$ D. C5 ^1 p4 S4 E6 X
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same as follows.
* E* y6 y  G# M& O% q
* c5 R# R+ _! I: I2.2 40日龄不同剂量组的抗体效价2 m* T5 M( m, C& \  N% L; ]
40日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后,其抗体产生速度较剂量1组快,免疫后第2周,各剂量组抗体效价均到达峰值,且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周,剂量1组抗体效价显著下降,剂量2、3、4组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价,剂量2、3、4组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间(表2)
: ~$ f& X$ g( l' H, l# H# F+ A2 P表2  40日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
; h/ b* s- z5 j7 iTable 2 .Diversification of the antibody of the 40 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine/ S; M# L# u" N' C: d+ Y
免疫剂量        免疫前        免疫后  q3 @, k$ I9 y- \
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
8 D7 z; K" y7 l6 |/ }4 ]% d1 j* I  M0        1.25±0.58        1.00±0.82b        0.75±0.96b        0.25±0.50b        0.20±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c! x. R- H. V5 Z# c0 y: T8 i1 Q
1        1.25±0.96        3.00±0.82a        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96b        3.00±0.82b        2.13±0.50b        1.83±0.58b
+ i! s' S& W6 q+ G) `+ r$ G2        1.33±0.58        4.33±1.15a        5.83±0.29a        5.17±0.29a        5.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        4.50±0.00a  i: u  g+ y) P4 X4 y0 F' K
3        1.27±0.58        4.00±1.00a        5.50±0.50a        5.17±0.29a        5.00±1.00a        5.00±0.58a        5.00±0.29a        4.50±0.00a" H. X' H8 `; S* ]! n6 ?' ?
4        1.33±0.58        4.33±0.58a        5.83±0.29a        5.17±0.35a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        5.00±0.35a        4.50±0.29a2 F9 o  h% T7 U3 L& j( N% g& X. v

" Q& h7 ]+ u) I) c5 l6 [2.3 45日龄不同剂量组的抗体效价( [: U( z: _5 J: Y2 j
45日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后,其抗体产生速度较剂量1组快,免疫后第2周,各剂量组抗体效价均到达峰值,且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周,剂量1组抗体效价显著下降,免疫后第5周,2~4单位剂量剂量组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价,2~4单位剂量剂量组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间(表3)。( k" |; @4 X7 I! m3 K% S
表3  45日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
; `/ u- _) J% DTable 3 .Diversification of the antibody of the 45 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
- u5 d6 b# R. g, L' a免疫剂量        免疫前        免疫后
2 T0 |: R, K' Z1 L+ D                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周: e) \2 B. X4 V0 _
0        1.00±0.57ab        0.80±0.96b        0.35±0.50b        0.25±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
7 ]) T6 w# J6 J6 ?$ d% H1        2.00±0.82a        3.25±1.26a        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96b        3.25±1.26b        2.38±1.79b        2.00±1.41b6 W3 {! F# v2 V: w/ @1 @
2        1.00±0.00ab        4.00±1.00a        5.17±0.58a        4.83±0.29b        5.16±0.76ab        5.50±0.45a        5.50±0.00a        4.75±0.59a, [+ e& \( E) o' f. u
3        1.00±1.00ab        4.47±0.50a        5.25±1.06a        5.50±0.00a        5.75±0.35a        5.25±1.06a        5.00±0.50a        4.50±0.56a
  b5 ^5 R4 r" P' a4        0.33±0.58b        4.33±0.58a        5.50±0.00a        5.50±0.00a        5.25±0.35ab        5.25±0.35a        5.00±0.50a        4.50±0.36a
% g- c) y0 r6 F1 T. m4 C9 `5 I; @( V! g6 E! I4 E
2.4 35、40、45日龄组免疫剂量1疫苗后的抗体效价8 A* j* S8 X4 Q% H
注射剂量1疫苗时,免疫后第1周,各日龄组之间抗体效价没有显著差异,免疫后2~3周,3个日龄组抗体效价均上升至峰值,40、45日龄组抗体效价均显著高于35日龄组,40、45日龄组之间抗体效价没有显著差异,35日龄组有效抗体维持时间为2周,40~45日龄有效抗体维持时间为4周(表4)0 A1 A& g4 o, H0 D, m* @3 @! O
表4  不同日龄幼兔免疫剂量1后抗体变化比较
. I2 _7 A" J4 d$ S/ `Table 4 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 1-unit dose of vaccine 3 F. |- K6 _" @. q' b
免疫日龄        免疫前        免疫后
6 n; J; p2 S7 H4 Z& T                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
% c- r1 ^* s- \4 l35日龄        2.50±0.41a        3.25±0.50        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00b        1.00±0.00b        0.75±0.50b        0.00±0.00b0 M: a6 s  E. o% Z3 R$ E' w
40日龄        1.25±0.96b        3.00±0.82        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96 ab        3.00±0.82a        2.13±0.50a        1.83±0.58a
; Z* I  P/ E  o+ ~1 C4 [4 y45日龄        2.00±0.82ab        3.25±1.26        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96a        3.25±1.26a        2.38±1.79a        2.00±1.41a+ T( ~- {1 o8 Q) {, B3 ?5 v
注:同列数据标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)。以下数据同。2 E3 }/ r! K  R, R* d4 Q
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.
$ u' I+ B. h9 p4 R: e7 j6 F5 S0 d4 [$ a+ Y" q
2.5 35、40、45日龄组免疫剂量2疫苗后的抗体效价
2 l# z1 u; T/ O: z1 s注射剂量2兔出血症疫苗之后,各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价,各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异,40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周,35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周,各组有效抗体维持时间没有显著差异(表5)
0 b7 e& x) o9 c. G表5  不同日龄幼兔免疫剂量2后抗体变化比较: o6 E. m0 x0 E' a, ?0 M
Table 5 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 2-unit dose of vaccine
( _+ _/ S& |8 T( A0 e% P免疫日龄        免疫前        免疫后
; u( m7 K" t# ?: r                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周' Z- |- h* ^; t( r! n
35日龄        2.00±1.00        4.00±0.00        4.66±0.58b        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71        4.50±0.73b        4.50±0.53
& v& x' V! c8 Q5 T7 [40日龄        1.33±0.58        4.33±1.15        5.83±0.29a        5.17±0.29ab        5.33±0.58ab        5.33±0.00        5.00±0.00ab        4.50±0.00- Y6 w2 k3 \7 F$ E3 E, h
45日龄        1.00±0.00        4.00±1.00        5.17±0.58ab        4.83±0.29b        5.16±0.76b        5.50±0.00        5.50±0.00a        4.75±0.59# W4 W; ~* z# v, E2 o8 A. |, B

, V( o7 w0 f% h2.6 35、40、45日龄组免疫剂量3、4疫苗后的抗体效价
- Z) w; P+ b# n* ?: N. O$ E& O* \用剂量3、4注射兔出血症疫苗后,各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价,各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异,40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周,35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周,各组有效抗体维持时间没有显著差异(表6、7)。" \( W2 x2 ?  H
表6  不同日龄幼兔免疫剂量3后抗体变化比较- z( V5 w8 }3 e. a% @' Q/ y! F
Table 6 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 3-unit dose of vaccine
: r4 h, C) }# k5 C3 z% S7 O: X; X免疫6 }9 x6 R3 V$ N- H4 D: a
日龄        免疫前        免疫后6 q+ ~3 [, k( \/ n4 b3 ?
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
  ~: b( ^9 b' w  j35日龄        2.00±1.00        4.00±1.00        4.33±0.58        5.33±0.58        5.00±0.00        5.25±0.35        4.25±0.23b        4.00±0.34$ O8 f/ h/ K* t7 B
40日龄        0.67±0.58        4.00±1.00        5.50±0.50        5.17±0.29        5.00±1.00        5.00±0.00        5.00±0.29a        4.50±0.00, ]3 [' \( p2 P, h
45日龄        1.00±1.00        4.47±0.50        5.25±1.06        5.50±0.00        5.75±0.35        5.25±1.06        5.00±0.50a        4.50±0.56
) Y' z! g: |7 Q, x/ |- q- b' H, Q* I* i# }* Y
表7  不同日龄幼兔免疫4单位剂量后抗体变化比较
$ ^# F' u- h" w7 V! P/ \Table 7 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 4-unit dose of vaccine
& _8 W: I5 C7 G9 A9 r" H" T( {- r& e9 Y免疫
& f+ D) F& P9 B  y% F3 s* Y日龄        免疫前        免疫后% s  D5 a+ W0 T# `
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
0 e6 r/ x, v! b. k. g35日龄        2.33±0.58a        4.00±1.00        4.33±0.58b        5.33±0.58        5.83±0.29        5.50±0.00        4.75±0.56        4.33±0.269 u1 d$ d- _+ m0 u$ U
40日龄        1.33±0.58ab        4.33±0.58        5.83±0.29a        5.17±0.35        5.33±0.58        5.00±0.00        5.00±0.35        4.50±0.29
" E" Z' {7 i( C# F# Y45日龄        0.33±0.58b        4.33±0.58        5.50±0.29a        5.50±0.00        5.25±0.35        5.25±0.35        5.00±0.50        4.50±0.36/ y$ ?' g# `; B. h* s+ e4 h

  ]' i& d% Q8 u% U( |7 R* s3 小结与讨论3 X, \  T$ a; J) O1 `1 O  o; ~
3.1 相同日龄免疫剂量与抗体产生之间的关系' J' y: S7 ]9 {- J$ X
35日龄的剂量2、3、4组的抗体峰值、有效抗体维持时间、抗体产生速度均显著大于剂量1组,但是剂量2、3、4组之间的抗体峰值、有效抗体维持时间没有显著差异,抗体产生速度与40、45日龄的剂量2、3、4组均为1周,抗体峰值的产生较40、45日龄的剂量2、3、4组仅慢1周。40日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异,剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。45日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异,剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。
0 E$ _+ z. z* S2 z5 L3.2 同一剂量的不同免疫日龄与抗体产生之间的关系
; n- A; W8 ?# I9 J( n* q" d免疫结果表明,不同日龄在免疫剂量1时,免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关。35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值均显著小于其它日龄组。免疫剂量2~4时,35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值与其它日龄组之间无显著差异。说明加大剂量之后,可以解决当前存在的免疫程序问题。! B$ `) x( ]3 x  d1 V. j  Z
        目前,国内幼兔免疫机理方面的研究开展很少,人们对其免疫规律以及机理还不是十分清楚。本研究结果证明了兔出血症免疫程序中确实存在一些问题,同时提出了一些建议以供参考,并为进一步的深层次研究提供了实践依据。/ I& }* e( a1 e
- y# I/ ]2 J) i' k( s
[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-1-31 16:25 编辑 ]
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发表于 2008-1-31 16:52:50 | 只看该作者
   【薛家宾】 victory    【薛家宾】 victory    【薛家宾】 victory
板凳
发表于 2008-2-2 00:50:54 | 只看该作者
谢谢教授........
4
发表于 2008-2-2 10:48:25 | 只看该作者
从薛老师得到的提示应该是35日龄的小日龄可以注射,加倍注射效果好。但是我们实际当中的商品肉兔都是28日龄断奶,到35日龄也隔了好几天了。我想问实际当中刚刚断奶时可否注射兔瘟疫苗?请薛老师看看行不行。
5
发表于 2008-2-2 14:04:42 | 只看该作者
兔瘟/波氏。魏氏苗的效果确实。大肠杆菌根本就多余,巴氏还有一定的用途
6
 楼主| 发表于 2008-2-3 08:45:07 | 只看该作者

回复 4楼 的帖子

建议再看一下另一篇文章-免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响.
5 J+ J7 H2 f; |/ S, I, c/ N$ n& C( M7 t
[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-2-3 08:46 编辑 ]
7
发表于 2008-2-3 20:45:34 | 只看该作者
:vic   【薛家宾】 victory    【薛家宾】 victory    【薛家宾】 victory tory:
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