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幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究
7 ?8 M& r8 g. Y3 u+ S9 j杨龙圣,薛家宾,徐为中,胡元亮( {: X; y0 u' }$ q; s8 m
: q6 G! @, P" o/ ?' B兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(RHD virus,RHDV)引起的家兔的一种急性、高度接触性传染病,常呈爆发性流行,发病率和死亡率极高,给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒(RHDV)对青年、成年兔致病高,对二月龄以下幼兔一般不感染发病[1~3]。近年来的幼兔发生兔出血症逐渐增多[4~6],一些学者认为初免日龄在45日龄左右为宜,最好是用兔瘟单苗加倍免疫注射,60日龄左右再加强免疫一次[7]。而一部分养殖单位在仔兔断奶前后(30-35日龄)就免疫兔瘟苗,仅用单倍剂量,不再加强免疫,有时会发生免疫注射兔瘟苗后仍然发生兔瘟病[8][9]。为探明免疫注射后仍然发病的根源,进行了本试验研究。旨在通过免疫日龄及剂量与抗体产生之间的关系研究,明确幼兔兔瘟苗免疫的客观规律。
4 |$ [4 K b$ o1 材料与方法
; c' G- m) f) A& K1.1 材料# H; R' l1 K9 G# H+ t
新西兰兔,35、40、45日龄。兔病毒性出血症组织灭活疫苗(批号20041201),阳性血清,阴性血清,兔出血症病毒(RHDV,皖阜株)均由江苏省农业科学院兽医研究所提供;人“O”型红细胞,由南京军区总医院提供。' D" i" @5 g8 @7 S# a
TGL-16G台式高速离心机,由上海医用分析仪器厂生产;WMK-2型37℃恒温箱,南京试验仪器厂;100µl移液枪,eppendorf公司生产;50孔U型血凝板。
& Q' a% [' w) H9 Q' v1.2 动物分组与血样处理) n$ c7 I# k% ?5 [$ u5 C
分别取35、40、45日龄幼兔各30只,每个日龄组分不免疫、免疫剂量1、免疫剂量2、免疫剂量3、免疫剂量4五个处理组,共15组,每个剂量组6只幼兔,颈部皮下注射兔瘟疫苗。注射疫苗后,每周1次耳静脉或心脏采血。血液置37℃温箱内1小时,10000rpm/min离心10min,吸取上清。血清置56℃水浴锅内30min后,用于测定抗体效价。1 K5 M! c/ c/ g6 V, u
1.3 兔瘟抗体效价的测定. ]( {$ [; ]- W4 X# u) M/ \
微量血凝抑制试验(HI)方法检测兔瘟抗体[10]。取50µl待检血清用等量生理盐水进行倍比稀释6个梯度,分别在每孔加入等量的4单位血凝病毒,37℃感作30min,加入等量的1%人“O”型红细胞,4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清作为对照。结果以平均数±标准差表示,用SPSS软件从剂量和日龄两个角度作统计分析。
6 v+ W/ m2 |: |: _; |% ^2 结果与分析
& L& n0 K7 X: ~$ ^2.1 35日龄不同剂量组的抗体效价
& ~, _+ D3 ~& @, |* z, B9 |; T35日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4后,其抗体产生速度较剂量1组快,剂量2、3、4组抗体效价一直显著高于剂量1组,剂量2、3、4组抗体效价峰值5.83显著高于剂量1组峰值3.25,有效抗体维持时间(>7周)大于剂量1组的2周。35日龄组幼兔剂量2、3、4组之间抗体产生速度、峰值、维持时间均无显著差异(表1)
" r# q0 x1 O7 ?2 e& v表1 35日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
( G9 J# M& R! h5 r7 _4 m; sTable 1. Diversification of the antibody of the 35 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine |* [, w+ Y9 t$ U$ a' M
免疫
, e% D T l% }8 D _4 J剂量 免疫前 免疫后) \2 @! M& ~3 O3 ~! Q) g9 h8 R
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周- K( b4 U* y- b
0 2.50±0.41 1.25±0.95b 1.00±0.82c 0.75±0.96c 0.25±0.50d 0.25±0.50d 0.00±0.00d 0.00±0.00c
1 o: Q! {5 ?4 |& t/ P1 }9 M1 2.50±0.41 3.25±0.50a 3.00±0.82b 2.38±0.48b 2.00±0.00c 1.00±0.00c 0.75±0.50c 0.00±0.00c
! s# W4 l# ?+ l" j$ Y2 2.00±1.00 4.00±0.00a 4.66±0.58a 5.50±0.71a 5.67±0.58a 5.00±0.71b 4.50±0.73ab 4.50±0.53a6 q7 N; c' v& B. h/ R
3 2.00±1.00 4.00±1.00a 4.33±0.58a 5.33±0.58a 5.00±0.00b 5.25±0.35ab 4.25±0.23b 4.00±0.34b- ]; R. @2 } `
4 2.33±0.58 4.00±1.00a 4.33±0.58a 5.33±0.58a 5.83±0.29a 5.50±0.00a 4.75±0.56a 4.33±0.26ab! f5 I- R1 P0 x& ?7 f1 }
注:同列数据标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)。以下数据同。" \/ \: i" O- C& O. u/ M7 r8 Y
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same as follows.
. U4 E( |& k1 c4 f2 Q& Z* @# u( g. v4 c8 R+ L
2.2 40日龄不同剂量组的抗体效价
5 A/ t& k4 r- ^! W40日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后,其抗体产生速度较剂量1组快,免疫后第2周,各剂量组抗体效价均到达峰值,且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周,剂量1组抗体效价显著下降,剂量2、3、4组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价,剂量2、3、4组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间(表2)! D4 O, u+ l, J9 E N1 m; m9 K
表2 40日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
: Z# S; R4 ^ c4 P1 @. nTable 2 .Diversification of the antibody of the 40 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
% @# g1 x! l: S, h N* ]/ x& x免疫剂量 免疫前 免疫后
/ k' Y4 L+ r. b' p3 V- z$ ` 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周$ `9 t4 M K+ q% R+ M" T
0 1.25±0.58 1.00±0.82b 0.75±0.96b 0.25±0.50b 0.20±0.50c 0.00±0.00c 0.00±0.00c 0.00±0.00c9 Y6 K; S1 [7 c. @+ I( {
1 1.25±0.96 3.00±0.82a 5.75±1.71a 5.00±1.83a 2.75±0.96b 3.00±0.82b 2.13±0.50b 1.83±0.58b
( g0 e1 A- a/ }! R2 1.33±0.58 4.33±1.15a 5.83±0.29a 5.17±0.29a 5.33±0.58a 5.33±0.58a 5.00±0.00a 4.50±0.00a2 D. x3 H: g4 X: t( H1 f
3 1.27±0.58 4.00±1.00a 5.50±0.50a 5.17±0.29a 5.00±1.00a 5.00±0.58a 5.00±0.29a 4.50±0.00a
" z% {: [' m9 Z. i8 l; s4 1.33±0.58 4.33±0.58a 5.83±0.29a 5.17±0.35a 5.33±0.58a 5.00±0.00a 5.00±0.35a 4.50±0.29a
4 {) ?: V6 _: S t$ X6 I4 A4 D
' }4 y7 Q: B3 w) b% f3 e2.3 45日龄不同剂量组的抗体效价3 q" P; \6 L6 V3 k: P+ s) e& N
45日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后,其抗体产生速度较剂量1组快,免疫后第2周,各剂量组抗体效价均到达峰值,且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周,剂量1组抗体效价显著下降,免疫后第5周,2~4单位剂量剂量组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价,2~4单位剂量剂量组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间(表3)。3 o: x- n# {- n& q% ^ v8 i
表3 45日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化& K5 `( Y: R5 r' d S5 R" E
Table 3 .Diversification of the antibody of the 45 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
' o; x/ r( d; A7 R4 s免疫剂量 免疫前 免疫后
1 K* F N" J) X0 C1 ?7 i* K6 D. { 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周
0 p1 P4 k/ [; ^' S2 K8 ?0 1.00±0.57ab 0.80±0.96b 0.35±0.50b 0.25±0.50c 0.00±0.00c 0.00±0.00c 0.00±0.00c 0.00±0.00c0 j# M% ?, {& s6 T
1 2.00±0.82a 3.25±1.26a 5.25±0.96a 5.50±1.29a 3.75±0.96b 3.25±1.26b 2.38±1.79b 2.00±1.41b
8 H0 y: Q) H7 r; }% K; ]8 C. |* r; X2 1.00±0.00ab 4.00±1.00a 5.17±0.58a 4.83±0.29b 5.16±0.76ab 5.50±0.45a 5.50±0.00a 4.75±0.59a
9 B% P# ?% {' t/ n8 H3 1.00±1.00ab 4.47±0.50a 5.25±1.06a 5.50±0.00a 5.75±0.35a 5.25±1.06a 5.00±0.50a 4.50±0.56a5 O6 {" q2 r) n" _0 ?
4 0.33±0.58b 4.33±0.58a 5.50±0.00a 5.50±0.00a 5.25±0.35ab 5.25±0.35a 5.00±0.50a 4.50±0.36a* M: o4 D: i+ D9 E8 L. b
% Q6 J z, k3 N. b5 E! S8 @
2.4 35、40、45日龄组免疫剂量1疫苗后的抗体效价9 _+ [; n I( l/ E- ^- u. Z
注射剂量1疫苗时,免疫后第1周,各日龄组之间抗体效价没有显著差异,免疫后2~3周,3个日龄组抗体效价均上升至峰值,40、45日龄组抗体效价均显著高于35日龄组,40、45日龄组之间抗体效价没有显著差异,35日龄组有效抗体维持时间为2周,40~45日龄有效抗体维持时间为4周(表4)
& z9 I2 U: }' h! m表4 不同日龄幼兔免疫剂量1后抗体变化比较, P" Q _6 }; \* q, |8 f
Table 4 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 1-unit dose of vaccine
% \/ x. F W$ `免疫日龄 免疫前 免疫后
7 L# w( ]9 r! M4 H 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周# H% v# a9 j; H& q5 T
35日龄 2.50±0.41a 3.25±0.50 3.00±0.82b 2.38±0.48b 2.00±0.00b 1.00±0.00b 0.75±0.50b 0.00±0.00b
; D! o. E0 |2 ?3 v7 ]7 _9 L5 m1 m& M40日龄 1.25±0.96b 3.00±0.82 5.75±1.71a 5.00±1.83a 2.75±0.96 ab 3.00±0.82a 2.13±0.50a 1.83±0.58a
7 t s& Q3 I3 @# h! Z8 l45日龄 2.00±0.82ab 3.25±1.26 5.25±0.96a 5.50±1.29a 3.75±0.96a 3.25±1.26a 2.38±1.79a 2.00±1.41a
" d2 V2 r& P u+ Z( m; b注:同列数据标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)。以下数据同。" C8 ]4 [& M9 N9 Q+ B4 H% l0 [
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.
- ~* s% W& O+ N7 G! Y3 v+ H0 s5 ?9 Z& U
2.5 35、40、45日龄组免疫剂量2疫苗后的抗体效价
8 E8 }1 ], w* G, r3 }5 G- | r8 E注射剂量2兔出血症疫苗之后,各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价,各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异,40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周,35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周,各组有效抗体维持时间没有显著差异(表5)( s. U$ w! Z3 b$ J' R' O
表5 不同日龄幼兔免疫剂量2后抗体变化比较
4 h( t, r' b% p7 R; l w! ]/ qTable 5 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 2-unit dose of vaccine ( U& F6 H. n' y/ }5 N: `% I+ @9 z
免疫日龄 免疫前 免疫后7 I6 ~: i3 Q& Y+ |2 g( H
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周% E) R H( s) {; l! ~
35日龄 2.00±1.00 4.00±0.00 4.66±0.58b 5.50±0.71a 5.67±0.58a 5.00±0.71 4.50±0.73b 4.50±0.53( m- c! x. Z& k7 D
40日龄 1.33±0.58 4.33±1.15 5.83±0.29a 5.17±0.29ab 5.33±0.58ab 5.33±0.00 5.00±0.00ab 4.50±0.002 ?; S5 b* N6 ~, ?9 q
45日龄 1.00±0.00 4.00±1.00 5.17±0.58ab 4.83±0.29b 5.16±0.76b 5.50±0.00 5.50±0.00a 4.75±0.59
; v$ N; W8 Q9 p9 P) b
$ a8 F$ W) o' [2.6 35、40、45日龄组免疫剂量3、4疫苗后的抗体效价- z$ M9 f, ~5 Y/ t9 h! y
用剂量3、4注射兔出血症疫苗后,各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价,各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异,40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周,35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周,各组有效抗体维持时间没有显著差异(表6、7)。
% I0 V& E2 [' G4 n2 j$ ?( v表6 不同日龄幼兔免疫剂量3后抗体变化比较4 i* O# I; [! z. w) Z
Table 6 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 3-unit dose of vaccine " l0 v, Y" ], c" I6 J
免疫# @/ i( \) ]7 _% B+ }% J( X7 Y
日龄 免疫前 免疫后
" ~8 e4 Y6 g: V) ]8 \ 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周
* P* ^5 ]- V/ C5 y7 |35日龄 2.00±1.00 4.00±1.00 4.33±0.58 5.33±0.58 5.00±0.00 5.25±0.35 4.25±0.23b 4.00±0.34 N) j9 y/ g; ~
40日龄 0.67±0.58 4.00±1.00 5.50±0.50 5.17±0.29 5.00±1.00 5.00±0.00 5.00±0.29a 4.50±0.00
0 s# N- ^5 S9 A* k+ O) a( ^45日龄 1.00±1.00 4.47±0.50 5.25±1.06 5.50±0.00 5.75±0.35 5.25±1.06 5.00±0.50a 4.50±0.56
" j, Q G( a, ~2 z! d6 H' H3 W7 x) }& @6 s& s
表7 不同日龄幼兔免疫4单位剂量后抗体变化比较, F1 {4 K! w# k
Table 7 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 4-unit dose of vaccine K9 c; Y0 F' b+ C n( M# i- ]
免疫
. e0 j( s8 t( z- i' Q( ^) o# T日龄 免疫前 免疫后. q7 I4 z2 y$ \' |" _
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周( A+ e7 h9 r# O6 Q% q& F' E9 T
35日龄 2.33±0.58a 4.00±1.00 4.33±0.58b 5.33±0.58 5.83±0.29 5.50±0.00 4.75±0.56 4.33±0.26
2 O" t1 ~* W6 b% @% _: o ?# G40日龄 1.33±0.58ab 4.33±0.58 5.83±0.29a 5.17±0.35 5.33±0.58 5.00±0.00 5.00±0.35 4.50±0.29
7 W3 K# z: Z( G! {. L% I0 D45日龄 0.33±0.58b 4.33±0.58 5.50±0.29a 5.50±0.00 5.25±0.35 5.25±0.35 5.00±0.50 4.50±0.36 N! v' d, E# s6 R
8 ^5 S6 T* u+ T u% g: Y: k* ^3 小结与讨论
% J4 }0 C d8 v4 n6 U3.1 相同日龄免疫剂量与抗体产生之间的关系
" b+ \1 O1 D% I! g) E# F% u: C35日龄的剂量2、3、4组的抗体峰值、有效抗体维持时间、抗体产生速度均显著大于剂量1组,但是剂量2、3、4组之间的抗体峰值、有效抗体维持时间没有显著差异,抗体产生速度与40、45日龄的剂量2、3、4组均为1周,抗体峰值的产生较40、45日龄的剂量2、3、4组仅慢1周。40日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异,剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。45日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异,剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。' u1 e* a# g" e2 `; k; a3 ~) a
3.2 同一剂量的不同免疫日龄与抗体产生之间的关系
) ]+ r+ G5 T' v免疫结果表明,不同日龄在免疫剂量1时,免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关。35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值均显著小于其它日龄组。免疫剂量2~4时,35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值与其它日龄组之间无显著差异。说明加大剂量之后,可以解决当前存在的免疫程序问题。
: |! c1 c: b- U% a3 n' _3 V+ y 目前,国内幼兔免疫机理方面的研究开展很少,人们对其免疫规律以及机理还不是十分清楚。本研究结果证明了兔出血症免疫程序中确实存在一些问题,同时提出了一些建议以供参考,并为进一步的深层次研究提供了实践依据。
. ~9 r* r$ r# F! @( f% {5 F
* J5 ?; k0 L$ Y: F/ K[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-1-31 16:25 编辑 ] |
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