幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究

薛家宾

幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究
; ?6 F1 |; a/ W  m# U杨龙圣，薛家宾，徐为中，胡元亮
. g9 z5 J+ N/ H; c! N( I
$ r& ?! `% m. l6 S& _, z兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（RHD virus，RHDV）引起的家兔的一种急性、高度接触性传染病,常呈爆发性流行，发病率和死亡率极高，给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒（RHDV）对青年、成年兔致病高，对二月龄以下幼兔一般不感染发病[1～3]。近年来的幼兔发生兔出血症逐渐增多[4～6]，一些学者认为初免日龄在45日龄左右为宜，最好是用兔瘟单苗加倍免疫注射，60日龄左右再加强免疫一次[7]。而一部分养殖单位在仔兔断奶前后（30-35日龄）就免疫兔瘟苗，仅用单倍剂量，不再加强免疫，有时会发生免疫注射兔瘟苗后仍然发生兔瘟病[8][9]。为探明免疫注射后仍然发病的根源，进行了本试验研究。旨在通过免疫日龄及剂量与抗体产生之间的关系研究，明确幼兔兔瘟苗免疫的客观规律。
) ~5 ~2 E4 w" w( F1 材料与方法
1.1 材料
& x5 u5 n; @0 y  A4 w+ g5 O新西兰兔，35、40、45日龄。兔病毒性出血症组织灭活疫苗（批号20041201），阳性血清，阴性血清，兔出血症病毒（RHDV，皖阜株）均由江苏省农业科学院兽医研究所提供；人“O”型红细胞，由南京军区总医院提供。
TGL-16G台式高速离心机，由上海医用分析仪器厂生产；WMK-2型37℃恒温箱，南京试验仪器厂；100µl移液枪，eppendorf公司生产；50孔U型血凝板。
1.2 动物分组与血样处理
+ L2 `0 m" T: V9 b& X分别取35、40、45日龄幼兔各30只，每个日龄组分不免疫、免疫剂量1、免疫剂量2、免疫剂量3、免疫剂量4五个处理组，共15组，每个剂量组6只幼兔，颈部皮下注射兔瘟疫苗。注射疫苗后，每周1次耳静脉或心脏采血。血液置37℃温箱内1小时，10000rpm/min离心10min，吸取上清。血清置56℃水浴锅内30min后，用于测定抗体效价。
1.3 兔瘟抗体效价的测定
微量血凝抑制试验（HI）方法检测兔瘟抗体[10]。取50µl待检血清用等量生理盐水进行倍比稀释6个梯度，分别在每孔加入等量的4单位血凝病毒，37℃感作30min，加入等量的1％人“O”型红细胞，4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清作为对照。结果以平均数±标准差表示，用SPSS软件从剂量和日龄两个角度作统计分析。
  s" D3 H: j' E6 i* N1 F: h: K, g2 结果与分析
2.1 35日龄不同剂量组的抗体效价
, J1 n* D% q$ e/ P6 H& n$ @3 \7 Y5 m35日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4后，其抗体产生速度较剂量1组快，剂量2、3、4组抗体效价一直显著高于剂量1组，剂量2、3、4组抗体效价峰值5.83显著高于剂量1组峰值3.25，有效抗体维持时间(>7周)大于剂量1组的2周。35日龄组幼兔剂量2、3、4组之间抗体产生速度、峰值、维持时间均无显著差异（表1）
2 s6 v) G" `8 F/ W; ]) X9 {5 E+ s表1  35日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
$ n, Q$ b% ^& \+ y. J6 [Table 1. Diversification of the antibody of the 35 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
( q% O1 g: S" r( ]; F免疫
剂量        免疫前        免疫后
( t( B# a" x1 _3 k) d) h                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
, x# E" A0 g- L+ I1 [2 q: _0        2.50±0.41        1.25±0.95b        1.00±0.82c        0.75±0.96c        0.25±0.50d        0.25±0.50d        0.00±0.00d        0.00±0.00c
1        2.50±0.41        3.25±0.50a        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00c        1.00±0.00c        0.75±0.50c        0.00±0.00c
) C$ T7 Y% P$ u9 {2        2.00±1.00        4.00±0.00a        4.66±0.58a        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71b        4.50±0.73ab        4.50±0.53a
3        2.00±1.00        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00b        5.25±0.35ab        4.25±0.23b        4.00±0.34b
4        2.33±0.58        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.83±0.29a        5.50±0.00a        4.75±0.56a        4.33±0.26ab
, K2 S6 F: C5 |注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same as follows.
8 ^9 r6 c6 A1 _3 O3 W1 k5 r
, C0 l+ w* d  P3 ]2.2 40日龄不同剂量组的抗体效价
( a0 ]( K: R( @! y6 l5 r" G40日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，剂量2、3、4组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，剂量2、3、4组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表2）
8 n: d% R- b+ j表2  40日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
" M6 s% J" O3 H( u6 `5 JTable 2 .Diversification of the antibody of the 40 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫剂量        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
2 j) J3 t' v; Z8 a6 o: L0        1.25±0.58        1.00±0.82b        0.75±0.96b        0.25±0.50b        0.20±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
' e/ [' S0 A2 J- i1 Z6 |1        1.25±0.96        3.00±0.82a        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96b        3.00±0.82b        2.13±0.50b        1.83±0.58b
6 x( f) K4 f# y, `2        1.33±0.58        4.33±1.15a        5.83±0.29a        5.17±0.29a        5.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        4.50±0.00a
3        1.27±0.58        4.00±1.00a        5.50±0.50a        5.17±0.29a        5.00±1.00a        5.00±0.58a        5.00±0.29a        4.50±0.00a
4        1.33±0.58        4.33±0.58a        5.83±0.29a        5.17±0.35a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        5.00±0.35a        4.50±0.29a
) x3 ^: T8 {' l0 D
2.3 45日龄不同剂量组的抗体效价
45日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，免疫后第5周，2～4单位剂量剂量组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，2～4单位剂量剂量组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表3）。
表3  45日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
Table 3 .Diversification of the antibody of the 45 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫剂量        免疫前        免疫后
4 G3 D0 L. [4 U                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
# m: z$ g: I& O/ _1 @4 C0        1.00±0.57ab        0.80±0.96b        0.35±0.50b        0.25±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
3 [2 I7 P, u0 ?" F( ?# c1        2.00±0.82a        3.25±1.26a        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96b        3.25±1.26b        2.38±1.79b        2.00±1.41b
2        1.00±0.00ab        4.00±1.00a        5.17±0.58a        4.83±0.29b        5.16±0.76ab        5.50±0.45a        5.50±0.00a        4.75±0.59a
3        1.00±1.00ab        4.47±0.50a        5.25±1.06a        5.50±0.00a        5.75±0.35a        5.25±1.06a        5.00±0.50a        4.50±0.56a
, B$ N3 M/ m3 G2 _1 [4        0.33±0.58b        4.33±0.58a        5.50±0.00a        5.50±0.00a        5.25±0.35ab        5.25±0.35a        5.00±0.50a        4.50±0.36a

! A( i4 O" k  ^7 p8 i1 `: x2.4 35、40、45日龄组免疫剂量1疫苗后的抗体效价
' p8 t1 ~; U# n5 x/ O注射剂量1疫苗时，免疫后第1周，各日龄组之间抗体效价没有显著差异，免疫后2～3周，3个日龄组抗体效价均上升至峰值，40、45日龄组抗体效价均显著高于35日龄组，40、45日龄组之间抗体效价没有显著差异，35日龄组有效抗体维持时间为2周，40～45日龄有效抗体维持时间为4周（表4）
表4  不同日龄幼兔免疫剂量1后抗体变化比较
Table 4 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 1-unit dose of vaccine
免疫日龄        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
$ B$ c4 l3 E8 i9 d2 i' m) `3 V35日龄        2.50±0.41a        3.25±0.50        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00b        1.00±0.00b        0.75±0.50b        0.00±0.00b
40日龄        1.25±0.96b        3.00±0.82        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96 ab        3.00±0.82a        2.13±0.50a        1.83±0.58a
5 i/ c; V" }: S- I, }45日龄        2.00±0.82ab        3.25±1.26        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96a        3.25±1.26a        2.38±1.79a        2.00±1.41a
1 [+ x( t$ a) I' N注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.
' P4 q) x) a3 D3 q
2.5 35、40、45日龄组免疫剂量2疫苗后的抗体效价
! Q* s+ H% a8 F7 @$ m$ o0 _& d+ b  _& L注射剂量2兔出血症疫苗之后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表5）
表5  不同日龄幼兔免疫剂量2后抗体变化比较
Table 5 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 2-unit dose of vaccine
- Y, L# W# W( |5 o免疫日龄        免疫前        免疫后
! e  m8 n3 K. I( N! H& p: g                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
35日龄        2.00±1.00        4.00±0.00        4.66±0.58b        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71        4.50±0.73b        4.50±0.53
& M  N2 T8 H$ R" o: R40日龄        1.33±0.58        4.33±1.15        5.83±0.29a        5.17±0.29ab        5.33±0.58ab        5.33±0.00        5.00±0.00ab        4.50±0.00
45日龄        1.00±0.00        4.00±1.00        5.17±0.58ab        4.83±0.29b        5.16±0.76b        5.50±0.00        5.50±0.00a        4.75±0.59

) Q% O8 C# b: A6 d; p& l$ R$ X2.6 35、40、45日龄组免疫剂量3、4疫苗后的抗体效价
用剂量3、4注射兔出血症疫苗后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表6、7）。
表6  不同日龄幼兔免疫剂量3后抗体变化比较
Table 6 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 3-unit dose of vaccine
% Q- X2 n& z6 S/ Z* R免疫
日龄        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
, ^! r4 I# K) P3 G5 [: x. G& P9 y35日龄        2.00±1.00        4.00±1.00        4.33±0.58        5.33±0.58        5.00±0.00        5.25±0.35        4.25±0.23b        4.00±0.34
40日龄        0.67±0.58        4.00±1.00        5.50±0.50        5.17±0.29        5.00±1.00        5.00±0.00        5.00±0.29a        4.50±0.00
45日龄        1.00±1.00        4.47±0.50        5.25±1.06        5.50±0.00        5.75±0.35        5.25±1.06        5.00±0.50a        4.50±0.56

表7  不同日龄幼兔免疫4单位剂量后抗体变化比较
$ X, m+ M$ _; F' mTable 7 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 4-unit dose of vaccine
9 T+ e$ p, l4 s$ J7 m- a免疫
日龄        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
. q/ B3 y' n. J  w35日龄        2.33±0.58a        4.00±1.00        4.33±0.58b        5.33±0.58        5.83±0.29        5.50±0.00        4.75±0.56        4.33±0.26
40日龄        1.33±0.58ab        4.33±0.58        5.83±0.29a        5.17±0.35        5.33±0.58        5.00±0.00        5.00±0.35        4.50±0.29
% ^" _" a  L6 b- B7 N45日龄        0.33±0.58b        4.33±0.58        5.50±0.29a        5.50±0.00        5.25±0.35        5.25±0.35        5.00±0.50        4.50±0.36
5 A2 U7 L, I$ y" e# q
3 小结与讨论
3.1 相同日龄免疫剂量与抗体产生之间的关系
! z" k7 D& S/ r7 a35日龄的剂量2、3、4组的抗体峰值、有效抗体维持时间、抗体产生速度均显著大于剂量1组，但是剂量2、3、4组之间的抗体峰值、有效抗体维持时间没有显著差异，抗体产生速度与40、45日龄的剂量2、3、4组均为1周，抗体峰值的产生较40、45日龄的剂量2、3、4组仅慢1周。40日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。45日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。
3.2 同一剂量的不同免疫日龄与抗体产生之间的关系
免疫结果表明，不同日龄在免疫剂量1时，免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关。35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值均显著小于其它日龄组。免疫剂量2～4时，35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值与其它日龄组之间无显著差异。说明加大剂量之后，可以解决当前存在的免疫程序问题。
        目前，国内幼兔免疫机理方面的研究开展很少，人们对其免疫规律以及机理还不是十分清楚。本研究结果证明了兔出血症免疫程序中确实存在一些问题，同时提出了一些建议以供参考，并为进一步的深层次研究提供了实践依据。
( ]  |1 {6 y4 I! ?& q3 l. ^
[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-1-31 16:25 编辑 ]

王高

好

qiuhuangang

谢谢教授........

王高

从薛老师得到的提示应该是35日龄的小日龄可以注射，加倍注射效果好。但是我们实际当中的商品肉兔都是28日龄断奶，到35日龄也隔了好几天了。我想问实际当中刚刚断奶时可否注射兔瘟疫苗？请薛老师看看行不行。

1985su

兔瘟/波氏。魏氏苗的效果确实。大肠杆菌根本就多余，巴氏还有一定的用途

薛家宾

建议再看一下另一篇文章-免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响.

+ e1 V) g5 Z- L[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-2-3 08:46 编辑 ]

张连春

:vic tory: