幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究

薛家宾

幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究
杨龙圣，薛家宾，徐为中，胡元亮
7 X. z+ C! }  ~. \4 u" k5 u2 J
1 T: p- K& m& d; M- l: E兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（RHD virus，RHDV）引起的家兔的一种急性、高度接触性传染病,常呈爆发性流行，发病率和死亡率极高，给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒（RHDV）对青年、成年兔致病高，对二月龄以下幼兔一般不感染发病[1～3]。近年来的幼兔发生兔出血症逐渐增多[4～6]，一些学者认为初免日龄在45日龄左右为宜，最好是用兔瘟单苗加倍免疫注射，60日龄左右再加强免疫一次[7]。而一部分养殖单位在仔兔断奶前后（30-35日龄）就免疫兔瘟苗，仅用单倍剂量，不再加强免疫，有时会发生免疫注射兔瘟苗后仍然发生兔瘟病[8][9]。为探明免疫注射后仍然发病的根源，进行了本试验研究。旨在通过免疫日龄及剂量与抗体产生之间的关系研究，明确幼兔兔瘟苗免疫的客观规律。
1 材料与方法
4 ^, y& M1 E; k  m- q& B4 R1.1 材料
新西兰兔，35、40、45日龄。兔病毒性出血症组织灭活疫苗（批号20041201），阳性血清，阴性血清，兔出血症病毒（RHDV，皖阜株）均由江苏省农业科学院兽医研究所提供；人“O”型红细胞，由南京军区总医院提供。
7 P; k) e, o& T1 B" a; g; {- Y( |TGL-16G台式高速离心机，由上海医用分析仪器厂生产；WMK-2型37℃恒温箱，南京试验仪器厂；100µl移液枪，eppendorf公司生产；50孔U型血凝板。
1.2 动物分组与血样处理
& w6 ]) h' f6 H3 O分别取35、40、45日龄幼兔各30只，每个日龄组分不免疫、免疫剂量1、免疫剂量2、免疫剂量3、免疫剂量4五个处理组，共15组，每个剂量组6只幼兔，颈部皮下注射兔瘟疫苗。注射疫苗后，每周1次耳静脉或心脏采血。血液置37℃温箱内1小时，10000rpm/min离心10min，吸取上清。血清置56℃水浴锅内30min后，用于测定抗体效价。
1.3 兔瘟抗体效价的测定
6 j, h! p' p7 l+ g$ X9 `! ?) k微量血凝抑制试验（HI）方法检测兔瘟抗体[10]。取50µl待检血清用等量生理盐水进行倍比稀释6个梯度，分别在每孔加入等量的4单位血凝病毒，37℃感作30min，加入等量的1％人“O”型红细胞，4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清作为对照。结果以平均数±标准差表示，用SPSS软件从剂量和日龄两个角度作统计分析。
3 |" ]) S3 x. ^! B5 g2 结果与分析
2.1 35日龄不同剂量组的抗体效价
* f3 s. }# z8 [' s6 M) N35日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4后，其抗体产生速度较剂量1组快，剂量2、3、4组抗体效价一直显著高于剂量1组，剂量2、3、4组抗体效价峰值5.83显著高于剂量1组峰值3.25，有效抗体维持时间(>7周)大于剂量1组的2周。35日龄组幼兔剂量2、3、4组之间抗体产生速度、峰值、维持时间均无显著差异（表1）
表1  35日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
Table 1. Diversification of the antibody of the 35 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
, X1 D8 _& I, `5 h6 j免疫
6 \3 d0 v6 |. J# t: M5 d$ j( z- S剂量        免疫前        免疫后
1 \* g/ M2 e8 r* J0 |                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
0        2.50±0.41        1.25±0.95b        1.00±0.82c        0.75±0.96c        0.25±0.50d        0.25±0.50d        0.00±0.00d        0.00±0.00c
1        2.50±0.41        3.25±0.50a        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00c        1.00±0.00c        0.75±0.50c        0.00±0.00c
2        2.00±1.00        4.00±0.00a        4.66±0.58a        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71b        4.50±0.73ab        4.50±0.53a
' C: f/ L! @0 N$ w) W9 ~3        2.00±1.00        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00b        5.25±0.35ab        4.25±0.23b        4.00±0.34b
$ K5 M5 G: Q; A1 Y) n6 t4        2.33±0.58        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.83±0.29a        5.50±0.00a        4.75±0.56a        4.33±0.26ab
注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
/ `+ q: J1 T2 ANote: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same as follows.

2.2 40日龄不同剂量组的抗体效价
40日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，剂量2、3、4组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，剂量2、3、4组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表2）
表2  40日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
Table 2 .Diversification of the antibody of the 40 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫剂量        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
" x( H4 a" @) a1 t' y* y7 w0 \3 m9 A0        1.25±0.58        1.00±0.82b        0.75±0.96b        0.25±0.50b        0.20±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
0 k& \1 ^! Q3 z7 v1        1.25±0.96        3.00±0.82a        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96b        3.00±0.82b        2.13±0.50b        1.83±0.58b
) F, a4 E* k9 h2 y2        1.33±0.58        4.33±1.15a        5.83±0.29a        5.17±0.29a        5.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        4.50±0.00a
3        1.27±0.58        4.00±1.00a        5.50±0.50a        5.17±0.29a        5.00±1.00a        5.00±0.58a        5.00±0.29a        4.50±0.00a
4        1.33±0.58        4.33±0.58a        5.83±0.29a        5.17±0.35a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        5.00±0.35a        4.50±0.29a

2.3 45日龄不同剂量组的抗体效价
1 [' }7 v% z/ B9 k- Z# p" C45日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，免疫后第5周，2～4单位剂量剂量组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，2～4单位剂量剂量组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表3）。
表3  45日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
2 e5 {3 D) X* x1 X: Z1 q$ ~3 ]* t+ WTable 3 .Diversification of the antibody of the 45 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫剂量        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
0        1.00±0.57ab        0.80±0.96b        0.35±0.50b        0.25±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
1        2.00±0.82a        3.25±1.26a        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96b        3.25±1.26b        2.38±1.79b        2.00±1.41b
2        1.00±0.00ab        4.00±1.00a        5.17±0.58a        4.83±0.29b        5.16±0.76ab        5.50±0.45a        5.50±0.00a        4.75±0.59a
9 _# G4 w! M) t' ?3        1.00±1.00ab        4.47±0.50a        5.25±1.06a        5.50±0.00a        5.75±0.35a        5.25±1.06a        5.00±0.50a        4.50±0.56a
3 N8 c- I$ m. r, @4        0.33±0.58b        4.33±0.58a        5.50±0.00a        5.50±0.00a        5.25±0.35ab        5.25±0.35a        5.00±0.50a        4.50±0.36a
  }/ n7 i, I: ~: X- w: b, H  c/ F
2.4 35、40、45日龄组免疫剂量1疫苗后的抗体效价
注射剂量1疫苗时，免疫后第1周，各日龄组之间抗体效价没有显著差异，免疫后2～3周，3个日龄组抗体效价均上升至峰值，40、45日龄组抗体效价均显著高于35日龄组，40、45日龄组之间抗体效价没有显著差异，35日龄组有效抗体维持时间为2周，40～45日龄有效抗体维持时间为4周（表4）
表4  不同日龄幼兔免疫剂量1后抗体变化比较
Table 4 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 1-unit dose of vaccine
免疫日龄        免疫前        免疫后
' m! N3 p! B# X- A7 r% Y1 _" J                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
4 ^  R$ E& i. l! t9 s35日龄        2.50±0.41a        3.25±0.50        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00b        1.00±0.00b        0.75±0.50b        0.00±0.00b
/ z! z" ~8 t. N6 Z( _+ e40日龄        1.25±0.96b        3.00±0.82        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96 ab        3.00±0.82a        2.13±0.50a        1.83±0.58a
, D2 R) _5 O( w% x" I7 R45日龄        2.00±0.82ab        3.25±1.26        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96a        3.25±1.26a        2.38±1.79a        2.00±1.41a
. X& x8 S2 t9 E+ s! B" C8 }# P8 v; Z注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.
9 |# |2 m- Y0 W9 |' S8 N
# s9 e+ o* s6 g4 R2.5 35、40、45日龄组免疫剂量2疫苗后的抗体效价
' x; s4 L$ Z% s& d4 E注射剂量2兔出血症疫苗之后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表5）
% g* S, Q3 p& r8 g9 y7 |0 ?表5  不同日龄幼兔免疫剂量2后抗体变化比较
" D$ @) u- I# VTable 5 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 2-unit dose of vaccine
/ r. m0 r/ [( i2 r7 `: Y/ }免疫日龄        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
4 b' t( T7 f3 y. }, _35日龄        2.00±1.00        4.00±0.00        4.66±0.58b        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71        4.50±0.73b        4.50±0.53
40日龄        1.33±0.58        4.33±1.15        5.83±0.29a        5.17±0.29ab        5.33±0.58ab        5.33±0.00        5.00±0.00ab        4.50±0.00
, d5 z$ W7 ^! s7 N5 h2 }45日龄        1.00±0.00        4.00±1.00        5.17±0.58ab        4.83±0.29b        5.16±0.76b        5.50±0.00        5.50±0.00a        4.75±0.59
0 T" Z/ O% z- H' _
, B, x  W9 p0 X6 Q2.6 35、40、45日龄组免疫剂量3、4疫苗后的抗体效价
用剂量3、4注射兔出血症疫苗后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表6、7）。
( M2 `5 t2 Q) u, b6 x. O表6  不同日龄幼兔免疫剂量3后抗体变化比较
Table 6 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 3-unit dose of vaccine
免疫
8 w& ^- E0 |; o日龄        免疫前        免疫后
' G9 c/ R3 m; W6 l                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
- i4 j- R2 C$ \* O$ W1 D6 a  n35日龄        2.00±1.00        4.00±1.00        4.33±0.58        5.33±0.58        5.00±0.00        5.25±0.35        4.25±0.23b        4.00±0.34
! R8 R* h- v6 W( d: T+ I40日龄        0.67±0.58        4.00±1.00        5.50±0.50        5.17±0.29        5.00±1.00        5.00±0.00        5.00±0.29a        4.50±0.00
) t" s4 f! w9 D: ~( }! Q; S6 S% x' y45日龄        1.00±1.00        4.47±0.50        5.25±1.06        5.50±0.00        5.75±0.35        5.25±1.06        5.00±0.50a        4.50±0.56
% r, j. }! ^9 ]4 a1 }
* |6 f# W. M0 C& h8 Z/ a表7  不同日龄幼兔免疫4单位剂量后抗体变化比较
$ A6 x" U% u& g4 n' GTable 7 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 4-unit dose of vaccine
免疫
! p6 d. W5 F) a# _% _4 _8 ~9 a8 j日龄        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
35日龄        2.33±0.58a        4.00±1.00        4.33±0.58b        5.33±0.58        5.83±0.29        5.50±0.00        4.75±0.56        4.33±0.26
( ^) p1 |- }* l2 V: |! s1 V40日龄        1.33±0.58ab        4.33±0.58        5.83±0.29a        5.17±0.35        5.33±0.58        5.00±0.00        5.00±0.35        4.50±0.29
45日龄        0.33±0.58b        4.33±0.58        5.50±0.29a        5.50±0.00        5.25±0.35        5.25±0.35        5.00±0.50        4.50±0.36
( C8 Q8 v/ K2 Y) E- U
, I" Q$ K- T, L+ {3 小结与讨论
8 z5 ~2 x7 `: J3.1 相同日龄免疫剂量与抗体产生之间的关系
35日龄的剂量2、3、4组的抗体峰值、有效抗体维持时间、抗体产生速度均显著大于剂量1组，但是剂量2、3、4组之间的抗体峰值、有效抗体维持时间没有显著差异，抗体产生速度与40、45日龄的剂量2、3、4组均为1周，抗体峰值的产生较40、45日龄的剂量2、3、4组仅慢1周。40日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。45日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。
3.2 同一剂量的不同免疫日龄与抗体产生之间的关系
免疫结果表明，不同日龄在免疫剂量1时，免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关。35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值均显著小于其它日龄组。免疫剂量2～4时，35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值与其它日龄组之间无显著差异。说明加大剂量之后，可以解决当前存在的免疫程序问题。
        目前，国内幼兔免疫机理方面的研究开展很少，人们对其免疫规律以及机理还不是十分清楚。本研究结果证明了兔出血症免疫程序中确实存在一些问题，同时提出了一些建议以供参考，并为进一步的深层次研究提供了实践依据。

) h3 u4 g( \% l3 e' z% ?2 ^[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-1-31 16:25 编辑 ]

王高

好

qiuhuangang

谢谢教授........

王高

从薛老师得到的提示应该是35日龄的小日龄可以注射，加倍注射效果好。但是我们实际当中的商品肉兔都是28日龄断奶，到35日龄也隔了好几天了。我想问实际当中刚刚断奶时可否注射兔瘟疫苗？请薛老师看看行不行。

1985su

兔瘟/波氏。魏氏苗的效果确实。大肠杆菌根本就多余，巴氏还有一定的用途

薛家宾

建议再看一下另一篇文章-免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响.
& Z3 T1 Y7 x5 q# t3 F2 ]
& X/ Y9 s$ G7 i' g8 Q[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-2-3 08:46 编辑 ]

张连春

:vic tory: