幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究

薛家宾 · 发表于 2008-1-31 16:24:05

幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究
杨龙圣，薛家宾，徐为中，胡元亮

兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（RHD virus，RHDV）引起的家兔的一种急性、高度接触性传染病,常呈爆发性流行，发病率和死亡率极高，给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒（RHDV）对青年、成年兔致病高，对二月龄以下幼兔一般不感染发病[1～3]。近年来的幼兔发生兔出血症逐渐增多[4～6]，一些学者认为初免日龄在45日龄左右为宜，最好是用兔瘟单苗加倍免疫注射，60日龄左右再加强免疫一次[7]。而一部分养殖单位在仔兔断奶前后（30-35日龄）就免疫兔瘟苗，仅用单倍剂量，不再加强免疫，有时会发生免疫注射兔瘟苗后仍然发生兔瘟病[8][9]。为探明免疫注射后仍然发病的根源，进行了本试验研究。旨在通过免疫日龄及剂量与抗体产生之间的关系研究，明确幼兔兔瘟苗免疫的客观规律。
1 材料与方法
1.1 材料
新西兰兔，35、40、45日龄。兔病毒性出血症组织灭活疫苗（批号20041201），阳性血清，阴性血清，兔出血症病毒（RHDV，皖阜株）均由江苏省农业科学院兽医研究所提供；人“O”型红细胞，由南京军区总医院提供。
TGL-16G台式高速离心机，由上海医用分析仪器厂生产；WMK-2型37℃恒温箱，南京试验仪器厂；100µl移液枪，eppendorf公司生产；50孔U型血凝板。
1.2 动物分组与血样处理
分别取35、40、45日龄幼兔各30只，每个日龄组分不免疫、免疫剂量1、免疫剂量2、免疫剂量3、免疫剂量4五个处理组，共15组，每个剂量组6只幼兔，颈部皮下注射兔瘟疫苗。注射疫苗后，每周1次耳静脉或心脏采血。血液置37℃温箱内1小时，10000rpm/min离心10min，吸取上清。血清置56℃水浴锅内30min后，用于测定抗体效价。
1.3 兔瘟抗体效价的测定
微量血凝抑制试验（HI）方法检测兔瘟抗体[10]。取50µl待检血清用等量生理盐水进行倍比稀释6个梯度，分别在每孔加入等量的4单位血凝病毒，37℃感作30min，加入等量的1％人“O”型红细胞，4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清作为对照。结果以平均数±标准差表示，用SPSS软件从剂量和日龄两个角度作统计分析。
2 结果与分析
2.1 35日龄不同剂量组的抗体效价
35日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4后，其抗体产生速度较剂量1组快，剂量2、3、4组抗体效价一直显著高于剂量1组，剂量2、3、4组抗体效价峰值5.83显著高于剂量1组峰值3.25，有效抗体维持时间(>7周)大于剂量1组的2周。35日龄组幼兔剂量2、3、4组之间抗体产生速度、峰值、维持时间均无显著差异（表1）
表1  35日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
Table 1. Diversification of the antibody of the 35 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫
剂量免疫前免疫后
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周
0 2.50±0.41 1.25±0.95b 1.00±0.82c 0.75±0.96c 0.25±0.50d 0.25±0.50d 0.00±0.00d 0.00±0.00c
1 2.50±0.41 3.25±0.50a 3.00±0.82b 2.38±0.48b 2.00±0.00c 1.00±0.00c 0.75±0.50c 0.00±0.00c
2 2.00±1.00 4.00±0.00a 4.66±0.58a 5.50±0.71a 5.67±0.58a 5.00±0.71b 4.50±0.73ab 4.50±0.53a
3 2.00±1.00 4.00±1.00a 4.33±0.58a 5.33±0.58a 5.00±0.00b 5.25±0.35ab 4.25±0.23b 4.00±0.34b
4 2.33±0.58 4.00±1.00a 4.33±0.58a 5.33±0.58a 5.83±0.29a 5.50±0.00a 4.75±0.56a 4.33±0.26ab
注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same as follows.

2.2 40日龄不同剂量组的抗体效价
40日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，剂量2、3、4组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，剂量2、3、4组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表2）
表2  40日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
Table 2 .Diversification of the antibody of the 40 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫剂量免疫前免疫后
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周
0 1.25±0.58 1.00±0.82b 0.75±0.96b 0.25±0.50b 0.20±0.50c 0.00±0.00c 0.00±0.00c 0.00±0.00c
1 1.25±0.96 3.00±0.82a 5.75±1.71a 5.00±1.83a 2.75±0.96b 3.00±0.82b 2.13±0.50b 1.83±0.58b
2 1.33±0.58 4.33±1.15a 5.83±0.29a 5.17±0.29a 5.33±0.58a 5.33±0.58a 5.00±0.00a 4.50±0.00a
3 1.27±0.58 4.00±1.00a 5.50±0.50a 5.17±0.29a 5.00±1.00a 5.00±0.58a 5.00±0.29a 4.50±0.00a
4 1.33±0.58 4.33±0.58a 5.83±0.29a 5.17±0.35a 5.33±0.58a 5.00±0.00a 5.00±0.35a 4.50±0.29a

2.3 45日龄不同剂量组的抗体效价
45日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，免疫后第5周，2～4单位剂量剂量组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，2～4单位剂量剂量组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表3）。
表3  45日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
Table 3 .Diversification of the antibody of the 45 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫剂量免疫前免疫后
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周
0 1.00±0.57ab 0.80±0.96b 0.35±0.50b 0.25±0.50c 0.00±0.00c 0.00±0.00c 0.00±0.00c 0.00±0.00c
1 2.00±0.82a 3.25±1.26a 5.25±0.96a 5.50±1.29a 3.75±0.96b 3.25±1.26b 2.38±1.79b 2.00±1.41b
2 1.00±0.00ab 4.00±1.00a 5.17±0.58a 4.83±0.29b 5.16±0.76ab 5.50±0.45a 5.50±0.00a 4.75±0.59a
3 1.00±1.00ab 4.47±0.50a 5.25±1.06a 5.50±0.00a 5.75±0.35a 5.25±1.06a 5.00±0.50a 4.50±0.56a
4 0.33±0.58b 4.33±0.58a 5.50±0.00a 5.50±0.00a 5.25±0.35ab 5.25±0.35a 5.00±0.50a 4.50±0.36a

2.4 35、40、45日龄组免疫剂量1疫苗后的抗体效价
注射剂量1疫苗时，免疫后第1周，各日龄组之间抗体效价没有显著差异，免疫后2～3周，3个日龄组抗体效价均上升至峰值，40、45日龄组抗体效价均显著高于35日龄组，40、45日龄组之间抗体效价没有显著差异，35日龄组有效抗体维持时间为2周，40～45日龄有效抗体维持时间为4周（表4）
表4  不同日龄幼兔免疫剂量1后抗体变化比较
Table 4 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 1-unit dose of vaccine
免疫日龄免疫前免疫后
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周
35日龄 2.50±0.41a 3.25±0.50 3.00±0.82b 2.38±0.48b 2.00±0.00b 1.00±0.00b 0.75±0.50b 0.00±0.00b
40日龄 1.25±0.96b 3.00±0.82 5.75±1.71a 5.00±1.83a 2.75±0.96 ab 3.00±0.82a 2.13±0.50a 1.83±0.58a
45日龄 2.00±0.82ab 3.25±1.26 5.25±0.96a 5.50±1.29a 3.75±0.96a 3.25±1.26a 2.38±1.79a 2.00±1.41a
注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.

2.5 35、40、45日龄组免疫剂量2疫苗后的抗体效价
注射剂量2兔出血症疫苗之后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表5）
表5  不同日龄幼兔免疫剂量2后抗体变化比较
Table 5 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 2-unit dose of vaccine
免疫日龄免疫前免疫后
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周
35日龄 2.00±1.00 4.00±0.00 4.66±0.58b 5.50±0.71a 5.67±0.58a 5.00±0.71 4.50±0.73b 4.50±0.53
40日龄 1.33±0.58 4.33±1.15 5.83±0.29a 5.17±0.29ab 5.33±0.58ab 5.33±0.00 5.00±0.00ab 4.50±0.00
45日龄 1.00±0.00 4.00±1.00 5.17±0.58ab 4.83±0.29b 5.16±0.76b 5.50±0.00 5.50±0.00a 4.75±0.59

2.6 35、40、45日龄组免疫剂量3、4疫苗后的抗体效价
用剂量3、4注射兔出血症疫苗后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表6、7）。
表6  不同日龄幼兔免疫剂量3后抗体变化比较
Table 6 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 3-unit dose of vaccine
免疫
日龄免疫前免疫后
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周
35日龄 2.00±1.00 4.00±1.00 4.33±0.58 5.33±0.58 5.00±0.00 5.25±0.35 4.25±0.23b 4.00±0.34
40日龄 0.67±0.58 4.00±1.00 5.50±0.50 5.17±0.29 5.00±1.00 5.00±0.00 5.00±0.29a 4.50±0.00
45日龄 1.00±1.00 4.47±0.50 5.25±1.06 5.50±0.00 5.75±0.35 5.25±1.06 5.00±0.50a 4.50±0.56

表7  不同日龄幼兔免疫4单位剂量后抗体变化比较
Table 7 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 4-unit dose of vaccine
免疫
日龄免疫前免疫后
1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周
35日龄 2.33±0.58a 4.00±1.00 4.33±0.58b 5.33±0.58 5.83±0.29 5.50±0.00 4.75±0.56 4.33±0.26
40日龄 1.33±0.58ab 4.33±0.58 5.83±0.29a 5.17±0.35 5.33±0.58 5.00±0.00 5.00±0.35 4.50±0.29
45日龄 0.33±0.58b 4.33±0.58 5.50±0.29a 5.50±0.00 5.25±0.35 5.25±0.35 5.00±0.50 4.50±0.36

3 小结与讨论
3.1 相同日龄免疫剂量与抗体产生之间的关系
35日龄的剂量2、3、4组的抗体峰值、有效抗体维持时间、抗体产生速度均显著大于剂量1组，但是剂量2、3、4组之间的抗体峰值、有效抗体维持时间没有显著差异，抗体产生速度与40、45日龄的剂量2、3、4组均为1周，抗体峰值的产生较40、45日龄的剂量2、3、4组仅慢1周。40日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。45日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。
3.2 同一剂量的不同免疫日龄与抗体产生之间的关系
免疫结果表明，不同日龄在免疫剂量1时，免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关。35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值均显著小于其它日龄组。免疫剂量2～4时，35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值与其它日龄组之间无显著差异。说明加大剂量之后，可以解决当前存在的免疫程序问题。
目前，国内幼兔免疫机理方面的研究开展很少，人们对其免疫规律以及机理还不是十分清楚。本研究结果证明了兔出血症免疫程序中确实存在一些问题，同时提出了一些建议以供参考，并为进一步的深层次研究提供了实践依据。

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